作者：严红 彭淑梅 罗其泰 邱春雷 延卫东
【摘要】 目的观察沉默Livin基因对大肠癌HT-29细胞凋亡和化疗敏感性的影响。方法采用脂质体转染技术将化学合成的Livin siRNA转入HT-29细胞，RT-PCR和Western印迹法检测转染效果。选用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用于转染和未转染的细胞，MTT检测各组细胞的增殖、流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果si-Livin1转染组Livinα mRNA、Livinβ mRNA和Livin蛋白表达水平较其余干扰组和对照组显著降低(P<0.01)。5-FU对HT-29细胞的生长抑制作用强于si-Livin1转染组(P<0.01)，而si-Li vin1+5-FU组对细胞的生长抑制率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01)。与空白对照组比较，si-Livin1转染可使细胞出现明显凋亡现象(P<0.01)，5-FU对细胞的促凋亡作用强于si-Livin1转染组(P<0.01)，si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01)。结论siRNA沉默Livin基因能够抑制HT-29细胞的生长，促其凋亡，提高5-FU的化疗敏感性。Livin基因有望成为大肠癌治疗的新靶点。
【关键词】 Livin;大肠癌;凋亡抑制蛋白;RNA干扰;细胞凋亡;化疗敏感性
【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of Livin gene silencing on chemotherapeutic sensitivity and apoptosis of colorectal carcinoma HT-29 cells.MethodsLivin specific siRNA oligonucleotides were designed and synthesized artificially. SiRNA was transfected into colorectal carcinoma HT-29 cells by lipofection technology. Transfection efficiency was detectedby Western blot and RT-PCR. The transfected and untransfected cells were incubated in the presence of 5-FU. Cellular proliferation activeties were assayed by MTT. The apoptosis of cells was assayed by flow cytometry (FCM).ResultsCompared with those of other transfected g roups and control group， the protein levels of Livin and the mRNA expressions ofLivinα and Livinβ were decreased significantly after transfected by si-Livin1(P<0.01). The growth inhibition rates of cells incubated in 5-FU were higher than those of transfected by si-Livin1 (P<0.01). The growth inhibition rates of cells affected by si-Livin1 and 5-FU were higher than those of single transfectedby si-Livin1 and single incubated in 5-FU significantly (P<0.01). The apoptosisrates of cells transfected by si-Livin1 were higher than those of control group(P<0.01)， but lower than those of incubated in 5-FU(P<0.01). The apoptosis ratesof cells affected by si-Livin1 and 5-FU were higher than those of single transfected by si-Livin1 and single incubated in 5-FU significantly (P<0.01). ConclusionsLivin gene silenced by siRNA induces growth suppression and apoptosis of HT-29 cells， which could increase the chemotherapeutic sensitivity of HT-29 cells. Livin gene stands a chance as a new target for colorectal carcinoma treatment.
【Key words】Livin; Colorectal carcinoma; Inhibitor of apoptosis proteins; RNA interference;Apoptosis; Chemosensitivity
目前认为细胞凋亡受到异常阻滞是恶性肿瘤发生、发展的重要因素，肿瘤的化学药物治疗主要是通过诱导凋亡而发生效应〔1〕。Livin也称为KIAP，是2000年发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的成员之一，对抑制细胞凋亡起着重要作用〔2〕。近年大肠癌的发病率逐年上升，治疗非常棘手，Livin为其基因治疗提供了一条新的途径〔3〕。本研究用基因克隆技术构建Livin靶向的小干扰RNA(siRNA)，并转染大肠癌HT-29细胞， 探讨Livin基因沉默后对大肠癌细胞凋亡和化疗敏感性的影响。
1材料与方法
1.1材料大肠癌HT-29细胞株由南昌大学第一附属医院消化研究所提供，DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。武汉晶赛生物科技有限公司设计合成3条Livin siRNA链、阴性对照链。转染试剂盒Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司。Trizol和PCR试剂购自天根生化科技公司。逆转录试剂购自Promega公司。兔抗人多克隆抗体Livin购自Santa Cruz公司。用于Western印迹法检测的增强化学发光试剂ECL购自美国Cell Signal公司。AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技公司。
1.2靶向链设计依据GenBank中人Livin 基因2个异构体已知序列(No.NM-139317，No.NM-022161)，针对这2个异构体的共同部分设计3条序列。Livin1靶序列：5′-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3′;Livin2靶序列：5′-CCGTGTCCATCGTCTTTGT-3′;Livin3靶序列：5′-CTGGCCTCCTTCTATGACT-3′。另外设计阴性对照siRNA：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′。
1.3细胞培养及细胞转染HT-29细胞用含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的DMEM 培养，细胞生长至80%时传代。转染前1 d将对数生长期的细胞以5×104/孔接种于6孔板，细胞融合达50%时进行转染。用脂质体LipofectamineTM2 000进行转染，以si-Livin1、si-Livin2、si-Livin3转染作为干扰组，以未转染组、阴性对照siRNA组、脂 质体组作为无关干扰对照组，转染方式按LipofectamineTM2000说明书进行。
1.4RT-PCR检测转染效果用Primer5.0软件设计引物，Livin 的上游引物为5′CGCACGGCACAAAGACGA3′，下游引物为5′GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA3′，Livinα与Livin β的产物长度分别为351 bp和297 bp。内参照β-actin的上游引物为5′AGCCATGTACGTAGCCATCC3′，下游引物为5′CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA3′，扩增片段228 bp，由上海生工生物技术公司合成。转染24 h后收获细胞，用Trizol试剂裂解细胞，按试剂说明书提取细胞总RNA逆转录合成cDNA第一链。再以c DNA为模板，用上述设计的RT-PCR引物按下述反应条件分离扩增Livin基因：95℃预变性5 m in，然后94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min扩增32个循环，最后72℃延伸10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以Livin和β-actin灰度值比值表示Livin表达的相对强度。
1.5Western印迹法检测转染效果消化、收集各组细胞。提取细胞总蛋白，将蛋白电泳分离，然后电转移至PVDF膜，加兔抗人Livin多克隆抗体(1∶500)，室温孵育2 h，加羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，显影后以β-actin为内参照，观察Livin蛋白表达强度。通过实验发现si-Livin1的干扰作用强于si-Livin2、si-Livin3，故选择si-Livin1进行后续实验的检测。后续实验分组为空白对照组(未作任何处理)、si-Livin1转染组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组、si-Livin1+5-FU组。
1.6MTT检测细胞的生长抑制率细胞以5×103/孔接种于96孔板，按上述分组，分别予以转染si-Livin1、250 μg/ml 5-FU作用48 h、si-Livin1转染24 h后予以250 μg/ml 5-FU作用48 h，各组设6个复孔。到收获时间后每孔加入20 μl MTT ，培养4h后弃上清液，加入150 μl DMSO，振荡10 min后酶标仪测定490 nm波长下吸光度(A)值，计算细胞的生长抑制率(%)=〔(对照组A值-实验组A值)/对照组A值〕×100%。
1.7流式细胞仪检测细胞凋亡细胞接种于6孔板后，按上述分组，分别予以转染si-Livin1、250 μg/ml 5-FU作用48 h、si-Livin1转染24 h后予250 μg/ml 5-FU作用48 h，各组设6个复孔。收集细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC染液1 μl、PI染液5 μl，混匀，避光室温反应5 min，1 h内上流式细胞仪检测。
1.8统计学方法所有数据采用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料以x±s形式表示，分类资料比较采用χ2检验，组间比较采用t检验。
2结果
2.1Livin siRNA降低HT-29细胞Livin mRNA的表达si-Livin1、si-Livin2、si-Livin3转染组中Livinα mRNA和Livinβ mRNA的表达水平与阴性对照siRNA组、脂质体组、未转染组相比降低，差异有统计学意义(P<0.01)。si-Livin1转染组中Livinα mRNA和Livinβ mRNA的表达水平低于si-Livin2、si-Livin3转染组，差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照siRNA组、脂质体组、未转染组之间Livinα mRNA和Livinβ mRNA的表达水平无差别(P>0.05)。各组细胞中Livinα mRNA和Livinβ mRNA的表达水平无差别(P>0.05)。见图1和表1。表1HT-29细胞转染后Livin mRNA表达情况图1转染后各组细胞Livin mRNA表达
2.2Livin siRNA降低HT-29细胞Livin蛋白的表达si-Livin1转染组、si-Livin2转染组、si-Livin3转染组、阴性对照siRNA组、脂质体组、未转染组Livin蛋白的相对含量分别为0.046±0.013、0.696±0.053、0.662±0.060、0.725±0.065、0.712±0.038、0.74 9±0.051。si-Livin1转染组中Livin蛋白的相对含量显著低于其余各组(P<0.01)，而其余各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。图2转染后各组细胞Livin蛋白表达
2.3细胞的生长抑制率检测MTT检测发现，分别予si-Livin1转染和5-FU作用于HT-29细胞均可抑制其增殖，且两组间比较有显著性差异(P<0.01)。si-Livin1+5-FU组对细胞的生长抑制率达47.56%，显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01)。见表2。
2.4细胞凋亡的检测流式细胞仪检测发现空白对照组、si-Livin1转染组、5-FU组、si-Livin1+5-FU组的凋亡率分别为(1.298±0.560)%、(11.596±1.349)%、(22.586±1.626)%、(34.119±2.947)%。与空白对照组比较，si-Livin1转染和5-FU作用均可使HT-29细胞出现明显的凋亡现象(P<0.01)，且组间比较有显著差异(P<0.01)。si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01)。见图3。图3si-Livin1和5-FU作用后流式细胞仪检测结果表2si-Livin1和5-FU对HT-29细胞生长抑制率的影响
3讨论
大量研究证实，肿瘤的发生发展和细胞增殖与凋亡动态平衡受破坏有关〔4，5〕。因此，诱导肿瘤细胞凋亡的策略已成为近年研究大肠癌防治的热点。目前已发现多种与凋亡相关的基因，包括IAPs、Bax、Smac等，其中IAPs是一凋亡抑制蛋白家族，普遍特征是含有IAP家族和胱氨酸酶结合的结构基础BIR(Baculoviral IAP Repeat，BIR)结构域。与其他IAPs家族成员相似，其抗凋亡活性主要依赖BIR的结构域〔6〕。Livin存在2个剪接异构体，较长链的剪接异构体称为Livinα，短链的异构体称为Livin-β〔7〕。Livin主要是通过直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspases，尤其是抑制caspase-3/-7和caspase-9活性，达到阻断凋亡受体及线粒体相关的凋亡途径，实现对细胞凋亡的抑制作用;还可通过激活TAK1/JNK1信号传导途径抑制细胞凋亡，这种作用受到线粒体释放的caspase活化蛋白(Smac)的调节〔8，9〕。因此，本研究采用RNA干扰技术沉默Livin的表达，促使细胞凋亡，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。国外研究显示，Livin在很多人类恶性肿瘤中高表达，如黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌细胞系、结肠癌细胞系、非小细胞肺癌和前列腺癌细胞，而在正常组织中较少表达或不表达〔10，11〕。本研究RT-PCR检测发现，大肠癌HT-29细胞中Livin mRNA呈特异性高表达，经Livin siRNA转染后表达明显减弱，且Livinα和Livinβ的表达无差别;Western印迹检测发现，经Livin siRNA转染的HT-29细胞蛋白表达明显降低，和RT-PCR检测结果一致，均以si-Livin1作用显著。应用MTT、流式细胞仪检测发现，si-Livin1转染组细胞可出现明显的生长抑制和凋亡现象。这些均提示Livin siRNA转染HT-29细胞能够显著干扰Livin基因的表达，有效抑制细胞增殖并诱导其凋亡，延缓HT-29细胞生长。
5-FU作为大肠癌的辅助化疗的一线药物，应用于临床已超过45年，随着各种增效剂以及化疗方案的不断改良，化疗有效率较之最初的5%～20%已有明显提高〔12〕。据此，本研究选择5-FU作为凋亡刺激因子，观察沉默Livin基因对大肠癌细胞株化疗敏感性的影响。用250 μg/ml 5-FU作用转染和未转染Livin siRNA的细胞48 h后，MTT法检测发现si-Livin1转染对HT-29细胞有生长抑制作用，但比5-FU作用弱，而si-Livin1+5-FU组对细胞的生长抑制率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组，说明si-Livin1转染后加强了5-FU对HT-29细胞的生长抑制作用。流式细胞学检测发现si-Livin1转染可使细胞出现明显的凋亡现象，但弱于5-FU对细胞的促凋亡作用，si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组，进一步说明转染si-Livin1后5-FU诱导HT-29细胞凋亡的比率明显增多。Schmolinger等〔13〕研究发现Livin高表达的黑色素瘤细胞可以有效抵抗抗癌药所致的细胞凋亡，不表达的正常细胞没有这种特性。同样本研究降低Livin表达可以有效促进5-FU所致的细胞凋亡，增强了HT-29细胞对5-FU的化疗敏感性。然而，不同的大肠癌细胞Livin基因沉默后对不同化疗药物、不同浓度和作用时间的化疗敏感性，还有待进一步的研究探讨。综上所述，在基因治疗方面，通过抑制Livin的表达诱导大肠癌细胞凋亡，提高化疗敏感性，是目前较有前景的研究方向。作为手术、放疗和化疗的辅助治疗手段，对减少肿瘤的转移和复发发挥重要作用。
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