【摘要】 目的探讨SRF和Myocardin在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中相互作用的机制。方法采用免疫共沉淀和凝胶迁滞分析(EMSA)的方法检测不同表型的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用以及SRF与其顺式元件相互结合的能力。结果与传代培养处于去分化状态的VSMC相比，原代培养处于分化状态的 VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明显增强，而且SRF与其顺式元件结合的能力显著提高。结论SRF通过与Myocardin相互作用形成多蛋白复合体，即可有效地提高SRF与DNA调控元件即CArG-box的结合能力，启动肌特异性基因的表达，从而调控VSMC的表型转化。
【关键词】 Myocardin; 血清应答因子;血管平滑肌细胞 ;表型 转化
血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及向内膜下迁移是动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的共同病理特征，而VSMC表型转化是上述机制发生的基础。因此，研究VSMC表型调节的分子机制，对上述相关疾病的防治具有重要意义。血清应答因子(SRF)与其顺式元件(CArG-box)之间的相互作用对于平滑肌标志基因的转录是非常重要的。但SRF这样普遍表达的转录因子能够选择性地激活平滑肌细胞特异性的基因转录，其机制尚不清楚。研究显示SRF对平滑肌特异性基因表达 的调节活性可受多个环节的调节，涉及SRF的表达、核转位、选择性拼接以及SRF自身的翻译后修饰等〔1，2〕。Myocardin与SRF相互作用而协同激活SRF依赖的基因转录最令人关注。但Myocardin在VSMC表型转化过程中的作用尚未见报道。故本研究观察在VSMC发生表型转化的过程中Myocardin和SRF相互作用的分子机制。
1材料与方法
1.1材料兔抗人Myocardin多克隆抗体(本室制备)，兔抗鼠SRF多克隆抗体(Santa Cruz 公司)，辣根过氧化物酶(HRP)-1标记的羊抗兔二抗(北京中山公司)，随机引物标记试剂盒、凝胶迁滞试验(EMSA)试剂盒(Promega公司)，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2细胞培养取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，用贴块法分离VSMC，加入含10%FBS的M199进行培养，用0.25% 胰蛋白酶消化传代，取3～7代细胞进行实验。
1.3原代VSMC培养按文献〔3〕方法。取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，剪碎后，用0.01%Ⅳ型胶原酶和0.1% 胰酶联合消化，8 000 r/min离心收集细胞，差速贴壁法纯化VSMC。
1.4免疫共沉淀按文献〔4〕方法用三去污裂解液分别裂解原代培养和传代培养的VSMC，收集细胞裂解液，离心取上清加入明胶缓冲液后，加入兔抗鼠SRF多克隆抗体(或兔抗人Myocardin多克隆抗体)，4℃摇动2 h。随后，加入蛋白A-Sepharose，4℃摇动过夜。离心收集蛋白A-抗原-抗体三元复合物。依次用NET-洗涤缓冲液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ洗涤沉淀，离心后用2×SDS上样缓冲液悬浮沉淀，100℃加热3 min后离心，取上清进行Western印迹检测SRF与Myocardin的相互作用。用法国Vilber Lourmat公司的Bio ID数码成像分析软件对Western 印迹结果进行定量分析。
1.5SRF结合元件CArG-box硫代反义寡核苷酸探针(ODNs)设计与合成按SM22α基因启动子近端CArG-box的碱基序列合成正链及互补链ODNs(上海生工生物工程公司)，正链序列：5′-CTTTCCCCAAATATGGAGCCTG-3′。将合成的正链及其互补链ODNs溶解于3×柠檬酸钠(SSC)溶液中，加热至80℃后，缓慢降温至55℃，使其退火生成双链ODNs。
1.6凝胶阻滞分析(EMSA)按文献〔3〕方法从原代和传代培养的VSMC中提取核蛋白。各取10 μg与末端标记的SM22α基因启动子近端CArG-box进行结合反应，以100倍过量的非标记探针作为特异性竞争结合对照。DNA-核蛋白复合物经4%PAGE分离后，-70℃放射自显影显现电泳区带的迁移变化。
2结果
2.1原代和传代培养的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用无论是用抗Myocardin抗体免疫沉淀原代和传代培养的VSMC提取物，再用抗SRF抗体做免疫印迹分析;还是用抗SRF抗体免疫沉淀原代和传代培养的VSMC提取物，再用抗Myocardin抗体做免疫印迹分析，结果均表明，在传代培养的处于去分化状态的VSMC中，很难检测到SRF和Myocardin复合物的形成。而在原代培养的处于分化状态的 VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明显增强。结果提示，SRF与Myocardin这个特异性转录因子的相互作用在VSMC表型转化中起着核心作用。见图1，图2。
2.2原代和传代培养的VSMC中SRF与DNA结合能力的改变EMSA结果表明，从原代和传代培养的VSMC细胞中提取的核蛋白都可与SM22α启动子近端CArG-box相结合，在4% PAGE上出现迁移率变慢的DNA-蛋白质复合物区带。其中表现出收缩表型特征的原代培养的VSMC中DNA-蛋白质复合物区带较表现出合成型特征的传代培养的细胞明显加深，说明核蛋白与DNA的结合能力显著增强。SRF-DNA复合物形成的特异性由过量未标记的竞争性结合而证实。原代培养的VSMC(收缩型)中 SRF结合CArG-box的能力明显增强，推测是由于SRF和Myocardin相互作用形成多蛋白复合体，有利于激活分化型标志基因的表达，从而调控了VSMC的表型转化。见图3。图1抗Myocardin抗体免疫沉淀VSMC图2抗SRF抗体免疫沉淀VSMC 图3SRF与DNA结合能力
3讨论
研究表明Myocardin可在多种非肌细胞中，以SRF依赖的方式启动平滑肌特异性基因的表达〔5〕，提示在组织特异性的平滑肌中Myocardin可能是SRF的重要辅助因子〔6〕。但在VSMC 表型转化过程中Myocardin和SRF的作用尚未见报道。本研究结果提示，在VSMC发生表型转化的过程中SRF起一个平台作用，可以募集其他的转录因子(例如myocardin)，SRF通过与一个或数个平滑肌特异性转录因子相互作用形成蛋白复合体，即可有效地提高SRF与DNA调控元件即CArG-box的结合能力，启动肌特异性基因的表达，从而调控了VSMC的表型转化。血清和纯化的生长因子通过两个独立的途径可刺激SRF的活化。其中，一条途径是通过有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶级联反应使得ETS-结构域转录因子家族中的三元复合物因子(ternary complex factor，TCF)发生磷酸化作用〔7〕;另一条是依赖Rho信号和actin动力学的途径〔8〕。但到目前为止，TCF非依赖性的途径如何直接调节SRF活性的具体机制尚不清楚。Myocardin可能在此机制中起一重要作用。有研究表明在RhoA信号刺激下actin发生聚合作用，因此原本被G-actin抑制的Myocardin相关转录因子(MRTFs)被释放出来，从胞浆移位至胞核，由此激活了SRF的活性〔9〕。因而推测Myocardin作为一个桥梁联系了Rho-actin信号和SRF依赖性的转录。在VSMC表型转化中其具体信号转导机制待进一步研究。
参考文献
1Owens GK，Kumar MS，Wamhoff BR.Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease〔J〕. Physiol Rev，2004;84(3):767-801.
2Wang D，Chang PS，Wang Z，et al.Activation of cardiac gene xpression by myocardin，a transcriptional cofactor for serum response factor〔J〕. Cell，2001;105(7):851-62.
3Gupta M，Kogut P，Davis FJ，et al.Physical interaction between the MADS boxof serum response factor and the TEA/ATTS DNA-binding domain of transcription enhancer factor-1〔J〕.J Biol Chem，2001;276(13):10413-22.
4郑斌，温进坤，韩梅.Hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的意义〔J〕.生物化学与生物物理学进展，2003;30(1):67-72.
5Wang DZ，Olson EN.Control of smooth muscle development by the myocardin familyof transcriptional coactivators〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2004;14(5):558-66.
6Wang J，Li A，Wang Z，et al.Myocardin sumoylation transactivates cardiogenicgenes in pluripotent 10T1/2 fibroblasts〔J〕.Mol Cell Biol，2007;27(2):622-32.
7Schratt G，Weinhold B，Lundberg AS，et al.Serum response factor is requiredfor immediate-early gene activation yet is dispensable for proliferation of embryonic stem cells〔J〕.Mol Cell Biol，2001;21(8):2933-43.
8Mack CP，Somlyo AV，Hautmann M，et al.Smooth muscle differentiation marker gene expression is regulated by RhoA-mediated actin polymerization〔J〕.J Biol Chem，2001;276(1):341-7.
9Medjkane S，Perez-Sanchez C，Gaggioli C，et al.Myocardin-related transcription factors and SRF are required for cytoskeletal dynamics and experimental metastasis〔J〕.Nat Cell Biol，2009;11(3):257-68.