【摘要】 目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆功能及海马谷氨酸含量、GABA受体表达的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、GABA组。采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立VD模型。GABA组术后腹腔注射GABA 0.5 g·kg-1·d-1，连续注射60 d。Morris 水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆行为;生物化学法测定各组大鼠海 马谷氨酸含量，免疫组化法观察大鼠海马CA1区GABA受体表达的变化。结果模型组大鼠存在明显的学习记忆功能障碍，与模型组比较，GABA组的学习记忆功能明显提高(P<0.05)，同时，其海马谷氨酸含量明显降低(P<0.01)，CA1区GABA受 体表达明显增加(P<0.01)。结论GABA可以改善慢性脑缺血致VD大鼠的学习记忆功能，增加海马GABA受体表达，拮抗谷氨酸兴奋性毒性可能是其机制之一。
【关键词】 血管性痴呆;γ-氨基丁酸;学习记忆; GABA受体;谷氨酸; Morris 水迷宫
血管性痴呆(VD)是指由于各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征。在各种脑血管疾病中缺血性脑血管病的发病率最高，也是VD最主要的致病因素〔1，2〕。γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布的重要的抑制性神经递质，约50%的中枢突触部位以GABA为递质〔3〕。在脑缺血时，GABA通过突触后、突触前抑制作用，拮抗谷氨酸的兴奋性毒性，减轻细胞损伤，有显著的神经保护作用〔4〕。但在脑缺血持续的病理损伤过程中，GABA的合成会被关闭，继之逐渐耗竭〔5〕，补充GABA对慢性脑缺血所致的VD是否产生影响尚不明确。本文观察了GABA对VD大鼠学习记忆功能及海马谷氨酸含量、GABA受体表达的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物和分组健康雄性SD大鼠，体重(200±20)g，南通大学医学院实验动物中心提供。大鼠适应性喂养3 d后，置于Morris水迷宫中学习训练2 d，于第3天选择4次均在90 s内找到平台的大鼠为合格实验大鼠，筛选出36只合格大鼠，按照随机原则分为3组：假手术组、模型组、GABA组，每组12只。
1.1.2主要仪器和试剂Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所;原料粉剂：美国Sigma公司，纯度为 99%;兔抗GABA多克隆抗体： 上海麦莎生物有限公司;谷氨酸及总蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所。
1.2方法
1.2.1VD动物模型制作用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备慢性脑缺血大鼠模型。大鼠仰卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，4号手术丝线双结扎双侧颈总动脉，于远近结扎点间剪断动脉，确保阻断颈总动脉血流，缝合切口。
1.2.2给药方法及剂量GABA组大鼠于模型制备完成后按0.5 g·kg-1·d-1给予GABA (生理盐水稀释成1 ml) 腹腔内注射，假手术组、模型组给予注射等量生理盐水，共60 d。
1.2.3行为学检测方法Morris水迷宫水池直径150 cm，高45 cm，水深32 cm。平台直径12 cm，高30 cm，固定于第Ⅲ象限。摄像镜头安放于水池中心上方2 m处。于造模后60 d进行，共7 d，分定位航行实验和空间探索实验。训练前24 h，大鼠迷宫中自由游泳3 min熟悉环境。第1～6天进行定向航行实验，第7天进行空间探索实验：撤去站台，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录120 s穿越站台次数。
1.2.4海马谷氨酸含量检测行为学检测结束后，各组中随机取6只大鼠，麻醉下断头取脑，立即用4℃生理盐水冲洗脑组织，除去血液，并迅速在冰盘上分离双侧海马，滤纸拭干，称湿重后，按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，按试剂盒步骤测总蛋白量及谷氨酸含量。
1.2.5免疫组织化学染色各组中其余6只大鼠用10 %水合氯醛麻醉后迅速剖开胸腔暴露心脏，将穿刺针经左心室插入升主动脉，灌注生理盐水约100 ml ，待血色变淡后继以4 %多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.4) 液灌注固定后断头取脑，将全脑依次移入含20%和30%蔗糖的PBS中进行梯度固定，置于4℃冰箱中至组织块沉烧杯底后，取大鼠前囟后3～3.8 mm区海马组织，作冰冻冠状连续切片，片厚30 μm，进行免疫组织化学染色，光镜下观察GABA受体的表达，并统计CA1区GABA阳性细胞数均值。
1.3统计学处理实验数据用STATA10.0 统计软件处理，统计结果以x±s表示，进行方差分析和两两比较。
2结果
2.1定位航行实验中潜伏期的比较 模型组与假手术组比较：第1天平均逃避潜伏期即明显延长(P<0.05) ;从第2天开始差异更显著(P<0.01) ;与模型组比较：GABA组第2天平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，第4天后两者的成绩差异更具显著性(P<0.01)。见表1。表1各组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期
2.2穿越隐匿平台次数的比较模型组穿越隐匿平台的次数是(1.80±1.21)次/120 s，GABA组为(3.81±2.42)次/120 s，假手术组的成绩是(4.83±2.01)次/120 s，模型组同GABA组和假手术组相比穿越次数的差异有显著性(P<0.01)，而GABA组大鼠穿越平台次数同假手术组相比，差异没有显著性(P>0.05)。
2.3各组大鼠海马谷氨酸含量检测结果慢性脑缺血2个月后，大鼠海马谷氨酸水平仍然较高，模型组谷氨酸含量为(0.483±0.012) mmol/g Prot，假手术组为(0.251±0.0 13) mmol/g Prot，与假手术组比较，模型组海马谷氨酸含量明显增加(P<0.01);而GABA组谷氨酸含量为(0.306±0.010) mmol/g Prot，较模型组明显减少(P<0.01)。
2.4免疫组织化学结果光镜下观察各组大鼠海马CA1区GABA免疫反应阳性细胞，并随机选择 3 个视野，计算其均值。假手术组细胞密集，排列有序，阳性细胞数为44.40±2.75。模型组细胞排列稀疏，阳性细胞数为24.27±1.65，与假手术组比较显著减少(P<0.01);GABA组阳性细胞数为38.83±1.67，与模型组比较明显增加(P<0.01)。见图1。图1各组大鼠海马CA1区GABA免疫组化(×400)
3讨论
双侧颈总动脉结扎法是目前常用的VD造模方法，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉后，造成一种慢性脑缺血低灌注状态，从而使脑组织，尤其是诸如海马、皮层等易损区域，产生缺血缺氧损害，其所致的一系列病理生理改变与人类血管性认知功能障碍改变相似〔6〕。Morris水迷宫是检测实验动物学习记忆能力的重要指标。本实验结果表明模型复制成功。脑缺血时，ATP合成不足和重摄取发生障碍，导致缺血区周围谷氨酸大量聚集，持续并过度刺激受体，导致Na+、Cl-大量内流，引起细胞急性渗透性肿胀以及细胞内Ca2+超载等一系列病理反应，最终导致神经元损伤，此即谷氨酸的兴奋性毒性作用〔7，8〕，它在脑缺血的病理生理机制中起重要作用，是脑缺血损伤的中心环节和脑组织损伤的启动者和执行者。本实验提示在双侧颈总动脉结扎2个月后，谷氨酸的兴奋性毒性作用仍然是存在的。GABA对脑缺血有显著的神经保护作用〔4〕，在脑缺血损伤早期，GABA急剧升高，与受体结合后，通过突触后膜超级化、减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制使突触后神经元处于保护性抑制状态，并可通过突触前抑制作用，减少谷氨酸的释放，减轻兴奋性毒性作用。但在脑缺血持续的病理损伤过程中， GABA的合成会被关闭，继之GABA逐渐耗竭，其机制包括：①在缺血性损伤早期，GABA大量释放，使递质耗竭;②GABA能神经为谷氨酸能后神经元，过度兴奋后可有细胞膜结构、功能暂时障碍，致前体物质摄取抑制;③缺血导致血脑屏障损害，大量GABA进入血浆，不能发挥神经保护作用。海马是脑内参与记忆贮存功能 的重要部位，其CA1区在学习记忆中起重要作用〔9〕。本实验中，模型组大鼠海马CA1区的GABA受体免疫阳性细胞数明显下降，可能是由于慢性缺血后GABA的合成逐渐减少，分泌、释放进入突触间隙的GABA水平相应下降，与突触后膜上GABA受体结合减少，致使表达量下降。而GABA受体的下调，打破了兴奋性和抑制性信号系统的平衡，改变了细胞生存的 微环境，导致神经元细胞的坏死、凋亡，损伤了学习记忆功能，推测海马GABA受体表达量的下降是慢性缺血致血管性痴呆的病理学基础之一。 GABA作用后，增强了GABA受体的表达，海马CA1区GABA受体表达量虽未接近假手术组水平，但较模型组明显增多，同时海马谷氨酸水平下降，在一定程度上减轻了兴奋性和抑制性信号系统的失衡，改善了学习记忆功能。
本实验提示，慢性脑缺血时，补充GABA能增强GABA受体的表达，拮抗谷氨酸兴奋性毒性作用，从而改善慢性缺血致VD大鼠的学习记忆功能。然而，本实验仅研究了慢性缺血2个月时大鼠海马谷氨酸含量及GABA受体表达的变化，随着缺血时间的延长，GABA是否能持续发挥其对认知的改善作用尚不明确，此外，脑内GABA受体类型较多，各受体亚型功能复杂，且在脑缺血不同时段发挥着不同的作用，其功能变化还不清楚，故GABA在改善VD认知功能的具体机制有待进一步深入地研究。
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