作者：张莉 吴赛珠 阮云军 洪雷 赖文岩
【摘要】 目的探讨小鼠体内雄激素水平缺乏对心脏衰老的影响。方法实验分为正常C57BL/ 6J雄鼠组(n=8)、去势组(n=8)、睾丸女性化鼠(tfm)组(n=10)、衰老组(n=8)。测定各组血清睾酮浓度，分离心肌组织测定组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平以及Western印迹测定去磷酸化Rb蛋白表达量。结果与正常组相比，衰老组、去势组tfm组血清睾酮浓度明显下降(P<0.01);心肌组织中SOD活性下降(P<0.05，P<0.01)、MDA含量增加(P<0.01);去磷酸化Rb蛋白表达量增加(P<0.01)。与衰老组相比，去势组和tfm组SOD活性、MDA含量及去磷酸化Rb蛋白表达量差异无统计学意义。结论体内雄激素水平缺乏可能通过增加活性氧水平(ROS)及Rb蛋白表达导致小鼠心肌组织衰老。
【关键词】 衰老;雄激素;去势;活性氧;去磷酸化Rb蛋白
【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of androgendeficiency on myocardium senescence in mice.MethodsAt 8 weeks of age， male C57BL/6 mice were randomly separated into control， castrated and senescence groups， each group had 8 mice. Tfm mice were used as tfm group (n=10). Besides senescence group， allgroupswere fed for 24 w. Blood was collected for measurement of testosterone concentrations. The activity of SOD and the level of MDA in the myocardium tissues weredetermined， and the expression of dephosphorylation Rb was detected by Western blot.ResultsCompared with those of control group， the lower testosterone concentrations (P<0.01)， the lower SOD activity(P<0.05) and higher MDA level (P<0.01)， dephosphorylation Rb expression (P<0.01)were observed in the senescence，castrated and tfm groups. Compared with senescence group， these changes had no significant difference between castrated and tfm groups.ConclusionsTestosterone deficiency is associated with myocardium senescence and this change may result fromthe increased ROS level and Rb protein expression in mice.
【Key words】Senescence; Androgen; Castration; Reactive oxygen species; Dephosphorylation Rb
目前研究已经表明活性氧(ROS)产生增多对人体衰老发挥重要作用〔1，2〕;衰老程序可通过p53和p16INK4a/pRb抑癌基因通路调节和维持〔3〕;且增龄过程中的一个显著变化是性激素平衡的改变。年龄与男性雄激素水平相关，随年龄增长外周循环中游离及总睾酮水平减低〔4，5〕。 男性睾酮水平随年龄及疾病的变化与心脏衰老变化之间有无一定的联系，目前研究还较少。本研究采用自然衰老、去势和雌性化(tfm)小鼠模型，观察体内雄激素水平缺乏时去磷酸化Rb蛋白表达和ROS的变化，从而探讨雄激素在心脏衰老中所发挥的作用。
1材料与方法
1.1动物及分组选用雄性8周龄和18月龄C57BL/6J鼠，购自南方医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK粤2006-0015)。实验用tfm小鼠由JAX实验室进口的一雌一雄鼠繁殖(雌性：AW-J/AW-JEdaTa-6J+/+Artfm;雄性：AW-J/AW-JEdaTa-6J+/Y)，后PCR法进行性别鉴别。SPF条件下分笼饲养，自由饮水及饮食，动物每日给予标准颗粒饲料。实验室严格控制温度(20℃~26℃)、湿度(40%~70%)、光线(12 h昼夜交替)等条件。实验分为4组：正常组(n=8)，6月龄C57BL/6J鼠;去势组(n=8)，8周龄C57BL/6J鼠去势后正常饲养至6个月;tfm组(n=10)，6月龄tfm鼠;衰老组(n=8)，18月龄C57BL/6J鼠。tfm鼠呈现雄激素受体(AR)编码基因的X染色体连锁的单碱基对缺失。这一缺失引起ARmRNA移码突变，导致AR提前终止〔6〕。所以，tfm鼠表现为无功能的AR，同时先天睾酮缺乏。
1.2主要试剂睾酮ELISA试剂盒由R&D公司提供;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;兔抗人/鼠Rbp103多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG二抗由武汉博士德公司提供;化学发光法(ECL)显影试剂盒由美国Pierce Biotechnology公司提供;二喹啉甲酸(BCA)试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司提供。
1.3血清睾酮浓度的测定各组小鼠处死前于9:00~11:00间眼球取血，静置30 min后，3 000 r/min 离心10 min，取血清测定睾酮浓度。
1.4SOD和MDA的检测处死小鼠后取心肌组织约50 mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，加入9倍于组织块重量的0.9%冷生理盐水，匀浆器冰上匀浆，匀浆液4℃，3 000 r/min 离心15 min，取上清制备成10%组织匀浆，稀释9倍制备成1%组织匀浆，-70℃保存。BCA法测定蛋白浓度。 MDA采用硫代巴比妥酸法;SOD采用Oyanagui 的亚硝酸盐形成法。严格按试剂盒说明书操作。
1.5去磷酸化Rb蛋白表达的测定各组取20 mg心肌组织加入组织蛋白提取液提取组织总蛋白，BCA法测量蛋白浓度。各组均取40 μg蛋白进行10%对钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺(SDS-polyacrylamide)凝胶电泳，然后电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，Tris缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，PVDF 膜与一抗1∶200稀释4℃孵育过夜， TBST 漂洗，再与HRP标记的羊抗兔IgG二抗室温下孵育1 h，TBST 漂洗，最后用ECL显影。图像分析仪(美国UVI soft软件)定量测定杂交信号的吸光度，用面积×密度代表表达量，相对光密度=目的蛋白/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达量。实验重复3次。
1.6统计学处理采用SPSS16.0 统计软件进行分析。所有数据均采用x±s表示。组间比较行单向方差分析LSD、SNK或Dunnett′s T3多重比较。
2结果
2.1各组小鼠血清睾酮浓度比较与正常组小鼠睾酮浓度〔(27.27±2.06) nmol/L〕相比，去势组〔(3.19±0.68) nmol/L〕、tfm组〔(4.27±1.21) nmol/L〕和衰老组〔(5.12±1.17) nmol/L〕小鼠血清睾酮浓度显著降低(P<0.01)。去势组和tfm组小鼠血清睾酮浓度差异无统计学意义。
2.2各组小鼠心肌组织SOD活性、MDA含量的比较与正常组小鼠比较，去势组、tfm组和衰老组小鼠心肌组织中SOD活性降低，MDA含量升高;与衰老组比较，去势组和tfm组小鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量差异无统计学意义。见表1。 表1四组小鼠心肌组织SOD活性及MDA含量比较图1Western印迹检测四组小鼠心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达结果
2.3各组小鼠心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达比较与正常组小鼠(0.21±0.03)比较，去势组(0.35±0.03)、tfm组(0.35±0.03)及衰老组(0.37±0.04)心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达量显著增加(P<0.01);与衰老组比较，去势组及tfm组小鼠心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达量无显著差异。见图1。
3讨论
性激素失衡是多种老年疾病和衰老的重要因素，男性表现为雌/雄激素比例失衡，女性表现为雌/孕激素比例失衡。以往的研究已证实40岁后男性血清睾酮水平每年减少约0.4%~2.6%〔1〕。年龄的老化使睾丸间质细胞的睾酮产生失去昼夜节律;老年男性睾酮产生率和血浆清除率均降低;老年男性睾酮对促性腺激素反应性减低。本研究发现衰老小鼠体内雄激素水平较正常水平降低，与Takeo〔7〕研究结果一致;而去势剥夺雄激素和无功能的AR受体小鼠体内总睾酮水平亦较正常水平明显下降。目前国内外已提出若干具有较高水平的衰老学说，包括自由基学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说、生物膜损伤学说、遗传程序学说、染色体突变学说、差错学说、内分泌学说等〔8〕。这些学说可分为两大类：一类为以ROS、糖基化、激素紊乱等损害为代表的环境伤害衰老理论，认为衰老是环境因素对细胞进行性和累积性毁坏的结果;另一类是以端粒缩短、细胞周期调控因子等为代表的遗传因子程序化衰老理论，认为衰老是机体有序的基因活动，是通过遗传按程序预先安排好的。
自由基学说是衰老机制研究中的一重要学说。ROS是组织细胞有氧代谢过程中产生的副产品。ROS在低水平时作为信号分子可调节细胞增殖和其他细胞功能〔9〕。然而，在高水平时可损伤细胞结构，包括DNA、RNA、蛋白质和脂质。MDA是体内ROS的产物之一，机体产生的ROS极易侵害细胞膜中的不饱和脂肪酸形成脂质自由基，引起脂质过氧化反应。MDA的高低反映了受自由基攻击的严重程度，作为评价脂质过氧化反应强弱的指标。为了避免有氧代谢过程中产生过多的氧化应激产物，哺乳动物细胞已形成一套保护系统，SOD是体内一种重要的抗氧化剂，是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的ROS清除剂，能够平衡机体的ROS。细胞周期调控因子与衰老密切相关，衰老程序通过p53和p16INK4a/ pRb抑癌基因通路来调节和维持的〔3〕。衰老时细胞周期的调控主要通过细胞周期蛋白依赖激酶抑制子(CDI)和Rb蛋白家族来协调的〔10〕。p16INK4a是重要的衰老基因，通过CDI催化Rb的磷酸化过程，p16抑制了使Rb磷酸化的细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)。当去磷酸化时， Rb结合和抑制转录因子E2F-1的活性，E2F-1可以激活进入S期所需要的基因亚基。故衰老时组织去磷酸化Rb蛋白表达量增加。本研究结果发现，外因造成的雄激素缺乏与增龄小鼠相似，体内ROS的清除功能降低(SOD活性下降和MDA含量升高)，以及去磷酸化Rb蛋白表达量增多。综上，体内雄激素水平缺乏与心脏衰老有关，心脏衰老是低内源性睾酮，而不是缺乏功能性AR的结果，因去势雄鼠存在功能性AR。循环中睾酮水平相对缺乏可通过增加ROS水平及 细胞周期调控因子去磷酸化Rb蛋白表达而导致心肌组织衰老。为进一步研究平睾酮干预对心脏衰老的影响及其机制奠定理论基础，对指导衰老相关的心血管疾病意义重大。
参考文献
1Wei YH，Wu SB，Ma YS，et al.Respiratory function decline and DNA mutation inmitochondria，oxidative stress and altered gene expression during aging〔J〕.Chang Gung Med J，2009;32(2):113-32.
2Ma YS，Wu SB，Lee WY，et al.Response to the increase of oxidative stress andmutation of mitochondrial DNA in aging〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1790(10):1021-9.
3Haferkamp S，Tran SL，Becker TM，et al.The relative contributions of the p53and pRb pathways in oncogene-induced melanocyte senescence〔J〕. Aging，2009;1(6):542-56.
4Carruthers M. Time for international action on treating testosterone deficiencysyndrome〔J〕.Aging Male，2009;12(1):21-8.
5Suzuki R，Allen NE，Appleby PN，et al.Lifestyle factors and serum androgensamong 636 middle aged men from seven countries in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC)〔J〕.Cancer Causes Control，2009;20(6):811-21.
6 He WW，Kumar MV，Tindall DJ.A frame-shift mutation in the androgen receptor gene causes complete androgen insensitivity in the testicular feminized mouse〔J〕.Nucleic Acids Res，1991;19(9):2373-8.
7Machida T，Yonezawa Y，Noumura T.Age-associated changes in plasma testosterone levels in male mice and their relation to social dominance or subordinance〔J〕.Horm Behav，1981;15(3):238-45.
8Bekaert S，van Pottelbergh I，De Meyet T，et al.Telomere length versus hormonal and bone mineral status in healthy elderly men〔J〕.Mech Ageing Dev，2005;126(10):1115-22.
9Sauer H，Wartenberg M，Hescheler J.Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation〔J〕.Cell Physiol Biochem，2001;11(4):173-86.
10Peeper DS，Dannenberg JH，Douma S，et al.Escape from premature senescence is not sufficient for oncogenic transformation by Ras〔J〕.Nat Cell Biol，2001;3(2):198-203.