作者：俞力 施良 戴莉敏 孙湘 范钰
【摘要】 目的探讨内脂素基因启动子-1535C/T多态性的分布及其与中国人2型糖尿病(T2DM)脂代谢紊乱的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术，检测208例初诊T2DM患者和162例糖耐量正常(NGT)者的内脂素基因启动子-1535C/T多态性，分析该基因多态性与腰围、BMI、血浆内脂素及血脂代谢指标的相关性。结果两组内脂素基因型分布及等位基因频率比较无统计学差异(P>0.05);但与TC、CC基因型患者比较，T2DM组TT基因型患者甘油三酯升高、HDL-C降低(P<0.05)。荧光素酶活性比较，pGL3 -1535T的相对荧光素酶表达活性较pGL3 -1535C下降了约28%(P<0.01)。结论内脂素基因启动子-1535C/T多态性与中国人T2DM脂代谢紊乱有相关性。
【关键词】 内脂素;多态性;2型糖尿病;血脂异常
内脂素是近年来发现的一种新脂肪因子，序列分析显示其为前B细胞克隆增强因子，因在内脏脂肪组织中高表达而命名。内脂素具有类胰岛素的降糖作用，并参与脂肪代谢及多种炎症反应，已成为代谢及炎症相关疾病的研究热点。有研究发现内脂素启动子区基因SNPs存在有意义的变异位点，部分位点的单核苷酸多态性(SNPs)与2型糖尿病(T2DM)、肥胖有关〔1〕。本文旨在探讨内脂素基因启动子-1535C/T多态性与T2DM脂代谢的关系。
1资料与方法
1.1一般资料2008年1月至2010年8月，随机选择无亲缘关系的镇江地区汉族人370例，根据1999年WHO制定的糖尿病诊断标准，其中确诊为初诊T2DM(T2DM组)208例，男112例，女96例，年龄34～75岁，平均(59.37±9.68)岁;糖耐量正常(NGT组)162例，男86例，女76例，年龄33～77岁，平均(56.75±8.75)岁。两组均未接受过降糖降脂治疗，排除糖尿病急性并发症、高血压、其他心血管疾病、肝肾功能损害，各种感染、创伤与应激等影响因素。两组患者年龄、性别经统计学分析均无显著差异(P>0.05)，具有可比性。
1.2方法
1.2.1内脂素基因启动子-1535C/T检测采用常规酚/氯法提取两组外周血白细胞DNA。目标基因PCR扩增：引物序列为上游引物：5′-ACACAGGGAAGATCAACCAA- 3′，下游引物5′-TATCTGGGGGCAGTGATGGT-3′，产物片段长332 bp。循环参数为95℃ 5 min，95℃ 30 s，54.4℃ 30s，7℃ 30 s共34个循环，最后72℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。PCR扩增产物纯化后经限制性内切酶ScrFI 37℃过夜，用4%琼脂糖凝胶电泳分离酶解产物片段，紫外光下观察酶切结果，判定基因型。
1.2.2血脂、血糖及血清内脂素检测取患者空腹12 h后静脉血，用全自动生化仪检测血清总胆大醇(TC)、三酰甘油(TG)、HDL-C;葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG);放免法检测空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数;高效液相法(日本京都全自动糖化血红蛋白分析仪，HA-8160)检测糖化血红蛋白(HbA1c)。ELISA法、美国产内脂素试剂盒 检测血清内脂素。同时计算BMI和腰臀比。
1.2.3荧光素酶报告基因表达载体的构建PCR引物：5′-ACACAGGGAAGATCAACCAA-3′和5′-CTCGGGCCGGAGGACAGGGGCCGC-3′，并用Pyrobest DNA多聚酶(Takara)扩增人类visfatin基因上游5′近端调控区序列，PCR产物胶纯化后克隆到pBlueScript (Stratagene)〔2〕。经测序无误后构建包含内脂素基因-1535C/T多态性的两种表达载体pGL3 -1535T及pGL3 -1535C。
1.2.4双荧光素酶活性测定按Promega公司提供的双荧光素酶检测方法进行，用1×PBS洗涤细胞2次，每瓶加入200 μl细胞裂解液收集细胞，冻融后12 000 r/min 4℃离心5 min。吸取20μl上清液加入100 μl Firefly荧光素酶底物(LRⅡ)，混合后用化学发光计测定荧光素酶的发光值;再加入100 μl的反应终止液(Stop&G10R)，测定作为内标的荧光素酶的发光值，两者比值即为荧光素酶的相对活性。
1.3统计学方法采用SASS11.5统计软件，数据呈非正态分布者进行对数转换;组间临床变量比较用单因素方差分析，根据基因型计算各基因型分布及等位基因频率;用SHEis软件行Hardy-Weinberg平衡检验。
2结果
2.1内脂素基因启动子-1535C/T多态性分析两组内脂素基因启动子-1535位点单核苷酸存在C/T多态性。基因型为CC时存在ScrFI限制性内切酶的酶切位点，酶切产物电泳后有103和229bp两条带;基因型为TT时该酶切位点消失，只有332 bp条带;基因型为TC时有103、229和332 bp三条带。
2.2内脂素基因启动子-1535C/T基因型分布和等位基因频率：两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律，说明本研究人群符合平衡群体。两组内脂素基因型分布及等位基因频率比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。表1两组内脂素基因型分布及等位基因频率比较
2.3内脂素基因启动子-1535C/T基因型分布和等位基因频率与肥胖的关系将受试者以BMI 25kg/m2为界分为肥胖组和非肥胖组，两组内脂素基因型分布及等位基因频率比较无统计学差异(P>0.05)。见表2。
2.4内脂素基因启动子-1535C/T基因型与糖脂代谢的关系单因素方差分析显示，T2DM组内脂素基因启动子-1535C/T基因型与HDL-C和TG相关，与TC、CC基因型患者比较，TT基因型患者TG升高、HDL降低(P<0.05);内脂素基因启动子-1535C/T基因型与其他检测指标比较均无统计学差异(P>0.05)。NGT组内脂素基因启动子-1535C/T基因型与各检测指标均无相关性(P>0.05)。见表3。表2肥胖组和非肥胖组内脂素基因型分布及等位基因频率比较表3不同基因型间临床和实验室指标的比较
2.5HepG2细胞荧光素酶的相对表达活性的测定包含内脂素基因-1535C/T多态性的两种表达载体pGL3 -1535T及pGL3 -1535C以及作为阴性对照的pGL3-Basic表达载体的荧光素酶的相对活性见图1。相对荧光素酶活性的比较显示pGL3 -1535T的相对荧光素酶表达活性(73.06±4.28)较pGL3 -1535C(88.10±5.31)下降了约28%(P<0.01)，pGL3-Basic的相对荧光素酶活性为22.13±2.26。图1三种表达载体结构示意图
3讨论
已有研究证实，小鼠转染含内脂素基因的质粒后，其血糖和胰岛素均显著下降;敲除内脂素基因小鼠则血浆内脂素下降，血糖升高，胰岛素无明显变化〔1〕，这提示内脂素在T2DM中起重要作用。人类内脂素基因位于染色体7q22.1～7q31.33，长37.4 kb，含11个外显子和10个内含子〔3〕。遗传学研究证明，正常墨西哥裔美国人血清TG、HDL-C与染色体7q22.2有相关性〔4〕。祝尔健等〔5〕证实，内脂素基因启动子-3186位点存在SNP，其变异与T2DM患者的BMI有一定关系。Tokunaga等〔6〕在日本T2DM人群中未发现与内脂素SNP-1535有相关性;而正常人群SNP-1535T/T基因型血清HDL-C显著升高，TG显著降低。因此认为，内脂素具有独立于胰岛素的类胰岛素作用效应。本研究显示，中国人内脂素基因启动子-1535位点的SNP存在T→C变异，呈现3种基因型;且其基因型分布在T2DM和NGT人群中无统计学差异，在肥胖和非肥胖者间亦无统计学差异;与TC、CC基因型患者比较，TT基因型患者TG升高、HDL-C降低，而3种基因型患者的其他检测指标比较均无统计学差异。相对荧光素酶活性的比较显示pGL3 -1535T的相对荧光素酶表达活性较pGL3 -1535C下降了约28%，提示其位点的基因多态性影响该基因启动子的转录活性。Ye等〔7〕报道，内脂素-1535T基因较-1535C基因的启动子活性下降1.8倍，内脂素基因启动子的转录活性改变对糖尿病患者的脂代谢有一定影响。Tokunaga等〔6〕发现，内脂素基因位点的基因突变与血中脂联素有相关趋势，但无统计学意义。这说明内脂素基因可能与其他因子共同构成复杂的脂肪因子调节系统，调控机体糖脂代谢。综上所述，内脂素-1535T/C与中国T2DM人群的HDL-C和TG有相关性，提示内脂素基因多态性可能对糖脂代谢有一定影响，其作用机制值得进一步研究。
参考文献
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2俞力，陈军建.人类CPF基因转录启动区上游的基因多态性对基因转录的影响〔J〕.江苏大学学报(医学版)，2005;16(6)：473-8.
3Samal B，Sun Y，Stearns G，et al.Cloning and characterization of the cDNA encoding a novel humanpre-B-cell colony-enhancing factor〔J〕.Mol Cell Biol，1994;14(2):1431-7.
4Arya R，Blangero J，Williams K，et al.Factors of insulin resistance syndrome-related phenotypes are linked to genetic locations on chromosomes 6 and 7 in nondiabetic mexican-americans〔J〕.Diabetes，2002;51(3):841-7.
5祝尔健，丁百静，朴云峰，等.内脂素基因多态性与2型糖尿病的关系〔J〕.山东医药，2008;48(7)：27-9.
6Tokunaga A，Miura A，Okanchi Y，The -1535 promoter variant of the visfatin gene isassociated with serum triglyceride and HDL-cholesterol levels in Japanese subjects〔J〕.Endocrine J，2008;55(1):205-12.
7Ye SQ，Simon BA，Maloney JP，et al.Pre-B-cell colony-enhancing factor as apotential novel biomarker in acute lung injury〔J〕.Respir Crit Care Med，2005;171(4):361-70.