作者：王玉霞 索琳娜 吴志香 纪红梅 宋玉萍
【摘要】 目的探讨PPARγ2基因Pro12Ala多态性与辽宁地区汉族老年人群超重和肥胖的相关性。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，对186例老年超重肥胖者和186例正常对照人群PPAR γ2基因外显子的Pro12Ala多态性基因型进行对照分析。结果PPARγ2基因12Ala等位基因在老年超重肥胖组和对照组的频率分别为4.3%、2.1%，两者间有显著性差异(P=0.046)。结论PPARγ2基因外显子的Pro12Ala多态性与老年超重和肥胖相关。
【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ2;基因多态性;超重;肥胖
【Abstract】ObjectiveTo determine frequencies distribution of peroxisome prolife rator activated receptorγ2 (PPARγ2) gene Pro12Ala polymorphism genotype and allele in Liaoning Han population， and the relationship with over weight and obesity of older persons.MethodsPolymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) was used to determine the distribution of allele and genotype frequencies of Pro12Ala polymorphism in (PPARγ2) gene in 186 over weight and obesity of older persons and 186 control subjects， case-contrastanalysis was used to study the association between Pro12Ala polymorphism and ov er weight and obesity of older persons.Results12 Ala allele frequencies in thecase and control groups were 4.3%，2.1%， 12 Ala allele was more frequent inthe over weight and obesity of older persons than that in the control subjects (P=0.046).ConclusionsPPARγ12Ala allele may be associated with over weight and obesity of older persons.
【Key words】Peroxisome proliferator activated receptorγ; Genetic polymorphism; Over weight;Obesity
近年来的研究表明，肥胖的发生与遗传基因、环境因素、膳食结构等多种因素有关，其中主要的决定因素是基因。机体体重的相对稳定涉及很多功能活动的调节，从基因水平看，体重调节系统是由一个相对庞大的基因组决定的。过氧化物酶体增殖激活受体γ基因(PPARγ)是一类基因转录子，是脂肪生成、脂肪细胞基因表达和胰岛素细胞间信号传递的主要调节者〔1〕。机体肥胖的发生发展往往是种族背景和遗传环境因素相互作用的结果〔2〕。PPARγ2基因34位核苷酸C→G突变即Pro12Ala多态性(导致第12位的脯氨酸替换为丙氨酸)与肥胖有关，但各人群的研究结果不一致。本研究旨在探讨PPARγ2基因Pro12Ala多态性与老年超重和肥胖的相关性。
1对象与方法
1.1对象遵循知情自愿的原则，在本院体检者中选取超重、肥胖者及健康体检者共372例，年龄≥60岁，在性别与年龄方面两组1∶1匹配 。根据亚太地区肥胖和超重的诊断标准：体质指数(BMI)≥23 kg/m2为超重，BMI≥25 kg/m2为肥胖。所有研究对象均无亲缘关系，且排除2型糖尿病(T2DM)及其他内分泌疾病。
1.2方法
1.2.1一般情况测量身高及体重，计算BMI， 测量收缩压(SBP)和舒张压(DBP)。受试者禁食12 h，于晨7时抽取肘静脉血4 ml测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)。
1.2.2基因组DNA的提取每位入选者抽取外周血3 ml，用酚-氯仿法提取基因组DNA。
1.2.3基因多态性检测应用PCR-RFLP方法检测Pro12Ala多态性。Taq DNA聚合酶及PCR反应试剂盒及Bstu-1内切酶均购自上海生工公司。琼脂糖试剂购自北京华美生物工程公司。应用下游错配引物在 Ala12等位基因上引入Bstu-1酶切位点。上、 下游引物参照有关文献设计，由上海生工公司合成。上游引物;5′-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3′，下游引物：GAT ATG TTT GCA GAC AGT GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G-3′。PCR反应体系为50 μl，包括：30.6 μl去离子水，5 μl缓冲液，1 μl Mg2+，4 μl dNTP，2 μl上游引物，2 μl下游引物，5 μl模板，0.4 μl Taq酶。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min;变性94℃ 45 s，退火61.6℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，39个循环;总延伸72℃ 10 min。PCR 扩增产物片段长为270 bp，取5 μl PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下确认呈现 270 bp特异PCR扩增产物后，继以限制性内切酶Bstu-1在 37℃水解过夜，置4℃保存。用3.0%琼脂糖凝胶电泳分离片段(100 V，1 h)，经溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察结果，照像并进行基因型分析。经酶切后，产生3种基因型：野生型纯合子(PP型)，无酶切位点，电泳条带为270 bp;突变型纯合子(AA型)，DNA的2条链上均有酶切位点，产生227 bp和43 bp两条带;杂合子为其中一条 DNA链上有酶切位点，产生227、43和270bp三条带。
1.3统计学处理运用基因计数法计算各组基因型频率和等位基因频率，用SPSS13.0统计软件进行处理，各组基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，计量资料间比较采用t检验。
2结果
2.1肥胖组与对照组一般特征比较肥胖组与对照组年龄、性别上无显著差异，BMI、TC、TG、FPG、SBP、DBP高于对照组，HDL-C低于对照组，以上差异均具有统计学意义(均P<0.05或P<0.01)。见表1。表1肥胖组和对照组一般特征比较
2.2肥胖组和对照组PPARγ2基因型和等位基因频率肥胖组与对照组PPARγ2基因型均以PP纯合子为多见，等位基因频率均以P为多见。A等位基因为少见基因型。由于AA突变率很低，统计分析时与PA合并在一起，两组间基因型比较无统计学差异，等位基因比较有统计学差异(P=0.046)，见表2。表2肥胖组和对照组基因型和等位基因频率比较
3讨论
PPARγ是属于核激素受体超家族的新成员，它是由英国科学家 Issemann等〔3〕于1990年首次发现的，人类的 PPARγ基因位于染色体 3p25，有 9个外显子。由于不同的启动子利用以及选择性剪接产生了4种mRNA异构体：PPARγ1、PP ARγ2、PPARγ3、PPARγ4 4种亚型。Yen等〔4〕1997年首次报道了 PPARγ2最常见的突变是在核苷酸34处即第12位密码子 CCA-GCA突变，造成脯氨酸变为丙氨酸，即Pro12Ala多态性。该多态位点位于外显子B上，为PPARγ2蛋白与脂肪细胞特异性结合的部位，同时为PPARγ2提供了非配体激活的结构域。肥胖是糖尿病、冠心病、高血压、高脂血症等许多严重疾病的共同危险因素，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。随着人民生活水平的提高和生活方式的改变，老年肥胖人数日趋 增多，所占比率逐年上升。超重和肥胖对老年人的身心健康造成极大威胁。医学专家指出，肥胖已成为现代生活的流行病和21世纪影响人类健康的主要危险因素之一〔5〕。脂肪组织不仅是能量储存的场所，还是一个具有多种内分泌，自分泌，旁分泌的内分泌器官。在遗传因素中寻找肥胖的候选基因是当前研究热点之一。Pima〔6〕在印第安人群中对肥胖及相关性状进行全基因组扫描，发现3p24、2p22与体脂含量连锁，此基因区域与PPARγ2基因相距较近(于3p25)。因此PPARγ2被认为是肥胖的候选基因。已知PPARγ2基因与脂肪细胞生成、分化、脂肪细胞基因表达、程序死亡的调节中起重要作用，因此Prol2Ala变异是否也影响肥胖的易感性引起了人们的兴趣。本研究中，老年肥胖组与对照组PPARγ2基因Pro12Ala多态性的基因型无统计学差异，而等位基因频率的分布差异有统计学意义，等位基因12Ala频率在肥胖组高于对照组，分别为4.3%、2.1%，提示12Ala等基因位与较高的BMI相关。目前，已有大量研究PPARγ2 基因Pro12Ala多态性与肥胖的相关性。结论不完全一致。Franks〔7〕对瑞典人群研究发现，携带Ala12基因的非糖尿病者较携带Pro基因者有较大的腰围及皮下脂肪堆集，说明在人类中 Prol2Ala影响非糖尿病人群对肥胖的敏感性 ，该突变是腹部皮下脂肪含量的独立危险因素。一项对芬兰女性肥胖患者(n=141)进行的研究发现Ala基因型与升高的BMI、脂肪含量相关〔8〕。艾智华等〔9〕的研究也表明在肥胖组中，Pro12Ala多态性与BMI、腰围和血TG水平相关，携带等位基因 Ala12者BMI、腰围和血TG均显著高于 Pro/Pro纯合子者， Pro12Ala多态性与 BMI相关(P<0.05)，提示在中国人群中 PPARγ2基因 Pro12Ala多态性可能与肥胖相关。这些研究结果与本研究的结论一致。也有学者得出相反的结论〔10〕。赵艳红等〔11〕研究认为男性对照组中Ala12等位基因与较低的BMI轻微相关(P=0.109)，最近有学者对肥胖儿童及青少年的基因型分析后认为Pro12Ala基因变异对儿童及青少年BMI没有影响 〔12〕。机体肥胖的发生往往是遗传背景和环境因素相互作用的结果。显然Pro12Ala多态性对肥胖的影响有限，其多态性可能与其他肥胖相关基因如PPARγ基因ts1875796多态性共同发挥作用〔13〕。脂肪细胞分泌的多肽如瘦素、脂联素、抵抗素等也可能参与其中，而且饮食结构和体育锻炼也有不同程度的影响。随着增龄食物摄入量呈线性下降，老年人的活动普遍减少，基因在肥胖中的作用可能比年轻人更易表现出来。
PPARγ2基因Pro12Ala变异对PPARγ2功能的影响尚不清楚。既往有研究在细胞水平上直接检测了PPARγ2基因的Ala变异对其转录激活活性的影响。在转染实验中发现PPAγ2基因的Ala变异使PPARγ2与PPRE的结合能力降低，并且在过表达突变型PPARγ2蛋白的细胞中，PPARγ2特异调节的靶基因的转录表达量降低。这些研究确切提示PPARγ2基因的Pro→ Ala变异降低了PPARγ2的转录激活活性，解偶联蛋白2(UCP2)表达不足，机体能量消耗减少，导致PPARγ2主要表达部位，即腹部皮下脂肪组织蓄积引起腹型肥胖，从而导致高BMI。但不排除其他未知或已知的肥胖基因及环境因素(如热量摄入等)对PPARγ2基因Pro12Ala变异的协同或干扰作用，这些尚需更全面的、大样本的基因联合变异研究。
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