肠易激综合征模型大鼠的大脑和消化道中5HT的表达与病理作用

　　　　 作者：邹百仓，董蕾，曹铭波，王燕，王深浩

【摘要】 目的 检测腹泻型肠易激综合征(DIBS)和便秘型肠易激综合征(CIBS)模型大鼠大脑及肠道组织中的5HT分泌表达的差异，探索5HT在IBS发病中的作用。方法 采用冰醋酸加束缚应激的方法造成DIBS动物模型，冰水灌胃法造成CIBS动物模型，并鉴定模型。用免疫组化方法检测各组大鼠海马、下丘脑、空肠、回肠、近端结肠、远端结肠组织中5HT阳性细胞并进行分析。结果 IBS模型经鉴定符合其病理特征。结肠组织分析显示各组大鼠均无明显炎性表现。DIBS组海马、下丘脑、空肠、回肠、近端结肠、远端结肠5HT阳性细胞数显著多于对照组(P<0.05)，并且空肠、回肠阳性细胞数也多于CIBS组(P<0.05)；CIBS组海马、下丘脑、回肠、近端结肠、远端结肠阳性细胞显著多于对照组(P<0.05)。结论 IBS模型大鼠大脑及肠道中5HT的增加与IBS发病相关，5HT在IBS不同亚型发病机制中的作用可能与其不同受体在大脑和消化道的表达分布差异有一定的关系。

【关键词】 便秘型肠易激综合征；腹泻型肠易激综合征；疾病模型；5羟色胺
　　
　　ABSTRACT: Objective To investigate the role of 5HT in the pathogenesis of irritable bowel syndrome (IBS) by examinining its expression difference in the brain and intestine of each IBS subgroup rat model. Methods Rat model of DIBS was established by colon instillation of acetic acid and restraint stress; rat model of CIBS was established by stomach irrigation with 0-4℃ cool water， and the positive and blank control were designed to identify rat model of IBS. The content of 5HT at hippocampus， hypothalamus， jejunum， ileum， proximate colon， and distal colon of each group rats was examined. Results The models of IBS were reliable by identification. The number of 5HT positive cells at hippocampus， hypothalamus， jejunum， ileum， proximate colon， and distal colon of DIBS group was significantly greater than that of control group (P<0.05)， and more were found in the IBSC group at jejunum and ileum (P<0.05). The number of 5HT positive cells of CIBS at hippocampus， hypothalamus， ileum， proximate colon， and distal colon was even greater than that of control (P<0.05). Conclusion The increased 5HT in the brain and intestine is related to IBS pathogenesis， while the role of 5HT in different IBS subgroups pathogenesis probably depends on the different expression or distribution of 5HT receptors in the central nervous systerm and gut.

　　KEY WORDS: diarrheapredominant irritable bowel syndrome; constipation predominant irritable bowel syndrome; model of disease; 5hydroxytryptamine

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome， IBS)是一种与胃肠道动力、神经内分泌以及感觉有关的复杂疾病。由于中枢神经、自主神经和肠神经系统的协调功能异常，而导致肠道的运动、感觉以及分泌活功能障碍，据症状可分为腹泻型肠易激综合征(DIBS)和便秘型肠易激综合征(CIBS)。5羟色胺(5hydroxytryptamine， serotonin， 5HT)是参与调节胃肠道运动和分泌功能的重要神经递质和旁分泌信号分子。近年来，大量的基础及临床研究使我们对5HT调控胃肠道功能的复杂机制有了深入的认识，同时推动了胃肠道功能性疾病发病机制及药物治疗的研究。对于IBS发病机制的研究，临床上因对象为患者，受方法和取材的限制无法系统进行。本课题采用文献方法制造IBS模型并进行鉴定，以便系统探讨5HT在IBS发病机制中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠40只，2月龄左右，体重220-250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，摄食饲料为西安交通大学医学院实验动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。所有大鼠都在安静、室温(18-20℃)、自然光线、昼夜循环12/12h条件下饲养。

　　1.2 主要试剂和仪器 兔抗鼠5HT受体一抗，第四军医大学微生物与免疫实验室提供。SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物公司提供。

　　1.3 分组与造模 40只成年雄性SD大鼠随机分为5组，每组8只。CIBS组：参照文献方法[1]每只给0-4℃生理盐水2mL灌胃，每天1次，共14d；灌胃对照组：每只给于常温水(26-28℃生理盐水)2mL灌胃，每天1次，共14d；DIBS组: 参照文献方法[2]实验前禁食12h后，乙醚吸入麻醉经肛门插入硅胶管，距肛门8cm，结肠内灌入40mL/L的冰醋酸1mL，保留30s后，用1mL PBS缓冲液冲洗结肠，缓慢拔出灌肠管，恢复6d；灌肠对照组：结肠内灌入1mL生理盐水，恢复6d；空白对照：不加干预，正常饲养14d。为消除生物节律的影响，均于上午8时开始灌胃、灌肠。

　　1.4 胃肠通过时间和粪便形状的检测 CIBS组和灌胃对照组于造模后(灌胃后)第15d，禁食12h，晨8时灌胃2mL印度墨汁，收集12h内的大便，计大便粒数，电子天平称湿重，微波烘烤干后称干重，计算大便含水量百分比。含水量百分比={(湿重-干重)/湿重}×100%。DIBS组和灌肠对照组于造模后第7天，禁食12h，晨8时灌胃2mL墨汁，并束缚前肢及颈部运动3h，收集每只大鼠应激期的粪便，计数大便粒数，称取湿重并烘干后称干重，计算大便含水量的百分比。空白对照组饲养7d，禁食12h后晨8时灌胃2mL墨汁，自由运动，收集每只大鼠3h内及12h内的粪便，计大便粒数，称大便湿重及干重，计算大便含水量的百分比，收集各组大鼠粪便同时记录黑便排出时间。我们用黑便排出时间代表胃肠通过时间。

　　1.5 直肠扩张反射实验 进行完以上实验后，5组大鼠分别在乙醚麻醉下，把Braun 8F导尿管外涂石蜡油后经肛门插入，大鼠放入鼠固定器内，限制大鼠的各项活动，但可观察到腹部收缩反射。用胶带在导尿管平肛门外缘水平固定于鼠尾，清醒15min后在大鼠安静状态下，经导尿管外口向球囊内注入常温水(26-28℃的生理盐水)，记录引起大鼠腹部收缩反射的最小注水量为最小容量阈值。重复扩张3次，每次间隔15min，以3次扩张测得的最小容量阈值的均值为直肠扩张引起腹部收缩反射的最小容量阈值。测定阈值后休息30min，分别测定注水量为0.8、1.2、1.6mL时3min内大鼠腹部收缩反射的次数，每次间隔15min. 用引起大鼠腹部收缩反射的最小容量阈值和直肠内球囊不同容量扩张时3min内大鼠腹部收缩反射的次数评价大鼠对直肠内扩张刺激的敏感性。

　　1.6 标本采集 进行完以上实验后，DIBS组、CIBS组和空白对照组大鼠在水合氯醛麻醉下(100g/L水合氯醛30mL/kg腹腔注射)，开胸暴露心脏，经左心室升主动脉灌流温生理盐水100mL以快速冲洗血液，随即以4℃ 40g/L的多聚甲醛缓冲液(pH 7.2)400mL灌注固定；开颅取出完整大脑，开腹取空肠(屈氏韧带下10cm)、回肠(盲肠上3cm)、近端结肠(盲肠下2cm)、远端结肠(距肛门10cm以上)长约2cm的肠段，以相同固定液固定24h，置于25g/L蔗糖缓冲液(pH 7.2)沉底，入液氮速冻后放-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机制作冰冻切片， 肠组织片厚12μm，脑组织(前囟后1.5mm至3.5mm)片厚16μm，贴片染色。

　　1.7 免疫组化检测与分析 组织切片加一抗5HT抗体(1∶1000)4℃孵育24h，依次加入二抗羊抗兔IgG(1∶100)和PAP复合物(1∶100)，37℃各孵育1h，DAB/h3O2 作显色反应。以上各步骤间均以0.01mol/L PBS(pH 7.4)充分漂洗切片。切片裱于凝胶玻片上，酒精逐级脱水，二甲苯透明，封片后光镜观察。随机挑选5个高倍视野，计数阳性细胞。

　　1.8 统计学处理 用SPSS软件对所测实验数据进行处理，实验结果以±s表示，多组间比较用方差分析，两两比较用LSDt检验。

　　2 结果

　　2.1 各组粪便的性状及黑便排出的时间 DIBS组束缚应激期(3h)大鼠粪便呈软便或糊状便，粪便颗粒数及湿重大于灌肠对照组和空白对照组(P<0.01)，粪便含水量明显多于空白对照(P<0.01)，DIBS组黑便排出时间明显短于空白对照组和CIBS组(P<0.01)。CIBS组12h粪便颗粒数及湿重均少于空白对照组和灌胃对照组(P<0.01，P<0.05)，粪便含水量与灌胃对照组和空白对照组显著减少(P<0.01，P<0.05)，CIBS组黑便排出时间明显长于灌胃对照组及空白对照组(P<0.05， P<0.01，表1)。

　　表1 各组排便情况的比较（略）

　　Table 1 The comparison of defecation in each group

　　▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs. control; **P<0.01 vs. colon instillation;☆P<0.05， ☆☆P<0.01 vs. stomach irrigation;ΔΔP<0.01 vs. CIBS; DIBS: irritable bowel syndrome with diarrhea; CIBS: irritable bowel syndrome with constipation

　　2.2 直肠扩张试验结果 DIBS组直肠扩张腹壁收缩最小阈值(threshold value of abdominal construction， TVAC)明显小于灌肠对照组、空白对照组及CIBS组，有统计学意义(P<0.05)，在0.8、1.2、1.6mL容量扩张时，DIBS组腹部收缩次数明显多于对照组和CIBS组，CIBS组直肠扩张收缩阈值明显高于灌胃对照组和空白对照组(P<0.01，P<0.05，表2)。

　　表2 直肠扩张腹壁收缩阈值及不同容量扩张时腹壁收缩次数的比较（略）

　　Table 2 The comparison of the threshold value of abdominal construction and times of abdominal construction in different volume

　　▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs. control; △P<0.05， △△P<0.01 vs. colon instillation; ◆P<0.05 vs. stomach irrigation， *P<0.05， **P<0.01 vs. CIBS; TVAC: threshold value of abdominal constructipn; DIBS: irritable bowel syndrome with diarrhea; CIBS: irritable bowel syndrome with constipation

　　2.3 肠道组织学分析结果 肠道组织HE染色显示，各IBS模型组大鼠空肠、回肠、结肠黏膜无明显炎性及其他病理损害(图1)。

　　2.4 5HT免疫组化染色后的阳性细胞 5HT染色结果显示，DIBS组海马、下丘脑、空肠、回肠、近端结肠、远端结肠5HT阳性细胞数显著多于对照组(P<0.05)，并且空肠、回肠阳性细胞数也多于CIBS组(P<0.05)，CIBS组海马、下丘脑、回肠、近端结肠、远端结肠阳性细胞显著多于对照组(P<0.05)，空肠5HT阳性细胞数与对照组无统计学差异(表3、图2)。

　　3 讨论
　　
　　IBS的发病机制尚不清楚，已经提出的有肠道动力异常、内脏感觉异常、脑、肠相互作用、炎症、肠道神经免疫内分泌网络调空失常等。肠道内分泌在肠道的运动、感觉等方面具有重要的作用，在IBS发病机制中的作用也倍受关注。5HT作为一种重要的神经递质，在IBS的发病机制中起着重要作用。最近，在人类和动物的研究中发现，肠黏膜受刺激使肠道产生蠕动，反射性的引起5HT的释放，作用于肠黏膜上皮内的5HT受体而发生作用[3]。近来有报道，腹泻型IBS患者的血浆5HT浓度较健康人明显增高[4]，IBS患者肠道分泌5HT的EC细胞明显增多，且功能活跃。提示大量合成分泌的5HT可能在IBS的发病中起作用[5]。

　　图1 IBS模型大鼠结肠的组织结构（略）

　　Fig.1 The colon tissue construction of IBS model rat

　　A: Colon of CIBS; B: Colon of DIBS (HE×200)

　　表3 5羟色胺阳性细胞数的比较（略）

　　Table 3 The comparison of 5HT positive cells

　　*P<0.05，**P<0.01， vs. control ; #P<0.05， ##P<0.01， vs. CIBS group; DIBS: irritable bowel syndrome with diarrhea; CIBS: irritable bowel syndrome with constipation

　　图2 海马及结肠组织中5HT阳性细胞的比较（略）

　　Fig.2 Expression of 5HT at hippocampus and distal colon of all groups (DAB×400)

　　A: hippocampus of control; B: hippocampus of DIBS; C: hippocampus of CIBS; D: distal colon of control; E: distal colon of DIBS;F: colon of CIBS
　　
　　对于IBS发病机制的研究，临床上因对象为患者，受方法和取材的限制无法系统研究，所以临床研究5HT和其他脑肠肽神经递质多以结肠为主，标本多为内镜下取材，主要是黏膜层，动物研究多以腹泻型为主，便秘型研究较少。我们采用传统的醋酸灌肠加束缚应激的方法造成DIBS动物模型，用新近文献报道的冰水灌胃的方法制造成CIBS模型，并进行鉴定。DIBS动物模型造模结束后，对直肠扩张刺激的敏感性持续增高，束缚应激可以引起大鼠排便的明显增多，粪便含水量增加，胃肠通过时间明显缩短，与DIBS的特征相吻合；CIBS模型造模结束后，与对照组比较，粪便颗粒数、含水量减少，胃肠通过时间延长。直肠扩张反射实验结果显示，CIBS模型引起腹壁收缩的阈值明显大于对照组，低容量和高容量扩张引起的腹壁收缩次数与对照组无差别，中等容量扩张引起腹壁反射次数高于对照组但无统计学意义。提示CIBS模型内脏敏感性有一定改变。关于CIBS患者的内脏敏感性报道不一，有报告认为CIBS患者的初始感觉阈值、疼痛阈值、排便阈值高于正常人，即CIBS患者内脏敏感性降低。但是，也有学者认为CIBS患者存在内脏高敏感[614]。提示CIBS患者存在内脏敏感性的改变。IBS大鼠肠道组织学无明显病理改变。我们认为IBS两型模型具有其相应的病理特征，可用于实验研究。
　　
　　5HT作为一种重要的神经递质，广泛存在于脑及消化道，在脑肠传导中起着重要作用。5HT在肠道主要储存于EC细胞及肠神经系统，也存在于中枢神经系统，而且是脑肠轴的重要递质。外周神经系统的5HT几乎全部由位于胃肠腺腔基底部的嗜铬细胞产生、贮存和再摄取。5HT及其受体参与了人体许多生理活动的调节，诸如睡眠、痛觉感受与镇痛、情绪及精神活动、内分泌等。这些生理活动功能区主要在皮质、海马和下丘脑。中枢和外周5HT及受体还参与调节胃肠运动和分泌反射的调控，也参与对内脏疼痛和不适的感知的调节。我们用免疫组化研究显示，在大脑5HT阳性染色广泛分布于皮质、海马、丘脑及下丘脑的神经元细胞、角质细胞和一些神经纤维上。在消化道5HT阳性细胞主要分布于胃肠腺腔基底部，少量分布于黏膜下神经丛神经元和神经纤维上。两型IBS 模型中海马和下丘脑5HT阳性细胞数均明显增多，DIBS模型大鼠消化道5HT阳性细胞数明显增多，并且在空肠和小肠多于CIBS组，CIBS组大鼠回肠和结肠明显多于对照组。说明中枢神经与消化道的5HT高表达在IBS发病机制中发挥着重要作用。但是，DIBS和CIBS有着截然不同的临床特征，IBS不同亚型中枢和消化道的5HT含量均升高，并且在结肠无显著差异。5HT在不同IBS亚型发病中如何发挥作用，我们推测可能IBS不同亚型的中枢或消化道的5HT受体表达分布存在差异，有待我们进一步研究。至今发现，5HT有7个受体家族(5HT17R)，且至少有15个受体亚型或识别位点。在肠道已发现5HT14和5HT7受体亚型[15]。现在研究较多的是5HT3、5HT4受体。5HT3 受体拮抗剂已用于治疗IBS及功能性胃肠病， 可全面改善患者症状，包括腹痛不适和肠道功能的改变。5HT4受体激动剂被认为是治疗便秘型IBS的有效药物，可提高胃动力、引起蠕动反射和肠道分泌、降低胃肠敏感性、缩短结肠传递时间。对于其他受体在IBS不同亚型的表达分布及功能差异有待进一步的研究。

参考文献

　　[1]La JunHo， Kim TaeWan， Sung TaeSik， et al. Visceral hypersensitivity and altered colonic motility after subsidence of inflammation in a rat model of colitis [J]. World J Gastroenterol， 2003， 9(12):27912795.

　　[2]彭丽华，杨云生，孙刚，等. 便秘型肠易激综合征新概念模型的建立 [J]. 世界华人消化杂志， 2004， 12(1):112116.

　　[3]Crowell MD. The role of serotonin in the pathophysiology of irritable bowel syndrome [J]. Am J Manag Care， 2001， 7(8):252260.

　　[4]Atkinson W， Lockhart S， Whorwell PJ， et al. Altered 5hydroxytryptamine signaling in patients with constipation and diarrheapredominant irritable bowel syndrome [J]. Gastroenterology， 2006， 130(1):3443.

　　[5]李兆申，詹丽杏，邹多武，等. 肠易激综合征患者分泌5羟色胺的肠嗜铬细胞形态及功能的改变 [J]. 中华消化杂志， 2004， 24(2):9497.

　　[6]肖文斌，刘兰，赵丽莉. 腹泻型、便秘型肠易激综合征和功能性便秘患者的直肠感觉阈值比较 [J]. 世界华人消化杂志， 2002， 10(11):12911294.

　　[7]Dickhaus B， Mayer EA， Fooz N， et al. Irritable bowe1 syndrome patients show enhanced modulation of visceral perception by auditory stress [J]. Am Gastroenter， 2003， 98(1):135143.

　　[8]Bouin M， Plourde V， Boivin RL， et al. Recta1 distention testing in patients with irritable bowel syndrome: sensitivity， specificity and predictive values of pain sensory thresholds [J]. Gastroenterology， 2002， 122(7):17711777.

　　[9]Malcolm A， Phillips SF， Kellow IE， et al. Direct clinica1 evidence for spinal hyperalgesia in a patient with irritable bowel syndrome [J]. Am Gastroenter， 2001， 96(8):24272431.

　　[10]李延青，王梅艳，吕国苹，等. 腹部冷刺激对肠易激综合征患者内脏感觉阈值的影响 [J]. 胃肠病和肝病学杂志， 2002， 11(4):339　341.

　　[11]詹丽杏，邹多武，许国铭，等. 功能性便秘和便秘型肠易激综合征的结肠运输试验及直肠感觉阈值比较 [J]. 中华消化杂志， 2002， 22(1):1921.

　　[12]王锦萍，叶玉津，胡品津，等. 腹泻型肠易激综合征直肠敏感性和心理健康状况的调查 [J]. 新医学， 1999， 30(12):729730.

　　[13]刘清英，刘静. 肠易激综合征患者肛门直肠感觉阈值和动力学的改变 [J]. 山东医药， 2003， 43(2):45

　　[14]Ragnarsson G， Hallbook O， Bodemar G. Abdominal symptoms and anorectal function in health and irritable bowel syndrome [J]. Scand Gastroenterol， 2001， 36(8):833842.

　　[15]De Ponti F. Pharmacology of serotonin : What a clinician should know [J]. Gut， 2004， 53(10):15201535.