中国云南地区3个少数民族DXS6799位点的遗传多态性

【摘要】 目的 采用分子克隆技术制备DXS6799位点等位基因分型标准物，并应用于傈僳、普米、德昂族群体的遗传多态性研究，实现短串联重复序列(STR)分型的准确性和标准化。方法 用PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离各等位基因片段，回收纯化后再次进行扩增，分别插入到pGEMT Easy质粒载体中，DNA测序证实插入片段的大小和结构，等位基因片段按国际标准进行命名后，经转化、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出该位点的等位基因分型标准物，进行群体遗传学研究。结果 应用此分型标准物调查了中国傈僳、普米、德昂族人群DXS6799位点的基因型分布频率。结论 此法制备的STR位点等位基因分型标准物在法科学实践中有较高的应用价值，DXS6799位点是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记。

【关键词】 等位基因分型标准物；短串联重复序列；DXS6799；遗传多态性

　　ABSTRACT: Objective To resolve the problem of the accuracy and standardization of short tandem repeatpolymerase chain reaction (STRPCR) typing in forensic practice， the molecular clone technology has been used in producing the standard allelic ladders of DXS6799 locus. And the standard allelic ladder was applied in studying the Lisu， Pumi and Deang populations in Yunnan Province， China. Methods Polymorphism of DXS6799 was analyzed by PCR and PAGE. Molecular cloning technology was employed to construct standard DXS6799 allelic ladder used for DXS6799 genotyping. Results The large quantities of standard allelic ladder of the locus were harvested， and the genetic polymorphisms of DXS6799 locus in three populations were studied. Conclusion The method is of high value for forensic DNA typing to construct standard ladders. DXS6799 is robust for genetic research and forensic application.

　　KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeats; DXS6799; genetic polymorphism

　　等位基因分型标准物(allelic ladder)是人群中常见的等位基因混合物，用来与未知样品比对确定基因型。等位基因分型标准物是短串联重复序列(STR)分型检测的组成部分，能够保证STR各等位基因分型的准确性。由于STR位点的某一等位基因在片段大小及序列上是唯一的，其在同等条件下电泳的迁移率也是一致的，所以等位基因分型标准物保证了对应STR位点的等位基因的正确命名。X染色体STR遗传标记的地位决定了等位基因分型标准物在法科学中的重要作用，特别是在一些复杂的亲属关系的鉴定中。随着X染色体上的STR位点研究的深入，将为X连锁遗传病的基因定位和基因诊断提供重要方法[12]。但是国内外分型标准物又缺少X染色体STR分型标准物。开发新的X染色体STR，首先就必须开发X染色体新STR位点的分型标准物，以保证分型的质量。为此，我们应用分子克隆技术，首先制备出DXS6799 位点的分型标准物，并应用自制的等位基因分型标准物首次调查了中国云南地区傈僳、普米、德昂族X染色体新STR位点DXS6799基因型分布频率，以评价该位点在法医学和群体遗传学中的应用价值。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 样本 遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区95名傈僳族(女性38名)、93名普米族(女性37名)、83名德昂族(女性38名)群体中无亲缘关系的个体的静脉血，EDTA抗凝，-20℃保存。

　　1.1.2 引物 引物序列查自GenBank，由奥科公司合成。序列为A：5′ATGAATTCAGAATTATCCTCATACC3′；B：5′GAACCAACCTGCTTTTCTGA3′。

　　1.1.3 试剂 2×Taq polymerase mix和DH5α感受态细胞(天为时代公司)；pGEMT EasyVector SystemⅠ(美国Promega公司)；聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司)；EDTA等其余试剂均为国产分析纯。

　　1.1.4 仪器 台式高速离心机(德国Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000μL，法国Gilson公司)；三相恒压电泳仪(美国BioRad公司)；干热器(美国Bellco公司)；旋涡混匀器(日本Tomy kogyo公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂)；低温冰箱(-30℃，-70℃，日本Sanyo公司)；ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 制备标准分型物模板DNA 通过Chelex法[3]提取云南普米族、傈僳族和德昂族群体样本DNA，PCR扩增。反应体系：总体积13μL，2×Taq polymerase mix 6μL，引物1μL(5μmol/L)，DNA 2μL，h3O 2μL。反应条件：94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min，30个循环。用60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度5%)电泳分离PCR扩增产物，银染显色。从群体样本的扩增产物中选出了6个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断，制备成PCR再扩增的模板。

　　1.2.2 PCR再扩增、产物鉴定及纯化 将制备好的6份DNA进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。

　　1.2.3 PCR产物的克隆 采用pGEMT Easy Vector SystemⅠ克隆试剂盒，将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5α感受态细胞，选择培养筛选，再用以上的扩增方法选出含有正确插入片段的克隆[45]。

　　1.2.4 重组质粒的DNA测序 采用ABI 3730全自动遗传分析仪，以质粒公用的M13正反引物对重组质粒的插入片段进行双向循环测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(international society of forensic haemogenetics， ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名[67]。

　　1.2.5 重组质粒的扩大培养及保存 对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养、纯化后，得到该位点的等位基因分型标准参照物重组质粒，-20℃保存。

　　1.2.6 等位基因分型标准物的制备和再鉴定 用含该位点等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系及条件如前。纯化该位点各等位基因的PCR产物，混合制备成等位基因分型标准物阶梯，通过60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得标准分型物的可用性。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS12.0统计学软件计算该位点等位基因片段的频率和基因型频率；采用χ2检验进行HardyWeinberg平衡吻合性检验[8]。根据95名傈僳族、93名普米族、83名德昂族无关个体该位点的等位基因和等位基因型，分别计算杂合度(H)、多态信息量(PIC)、女性个体识别率(PDF)及男性个体识别率(PDM) [910]。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒插入片段的序列分析及DXS6799位点阶梯状分型标准物的制备 据ABI3730测序结果分析(图1)，得知DXS6799位点的6个插入片段是以四核苷酸tatc为核心序列重复8-13次，其长度为236-256bp，与GenBank中公布的数据完全一致。根据ISFH规定的命名原则，插入片段的几个等位基因分别命名为8-13。用分子克隆技术制备等位基因的阶梯状分型标准物见图2。

　　2.2 分子克隆制备的DXS6799位点分型标准物应用于群体研究 将制备的DXS6799位点阶梯状分型标准物用于云南地区傈僳、普米和德昂族群体，分别检出6个、6个和5个等位基因，12个、10个和5个基因型，等位基因频率见表1，基因型分布见表2，杂合度(H)、多态信息量(PIC)、女性个体识别率(PDF)及男性个体识别率(PDM)见表3。

　　图1 重组质粒插入片段序列图（略）

　　Fig.1 The sequence of insertion element in recombinant plasmid (repeat: 11， size: 248bp， complementary strand)

　　图2 DXS6799等位基因分型标准参照物电泳分型结果（略）

　　Fig.2 The electropherotyping results of DXS6799 allelic ladder

　　L: Mixed DXS6799 allelic ladder; 16: standard DXS6799 allelic fragments which were reamplified from 6 respective recombinant plasmids

　　表1 DXS6799位点在傈僳族、普米族、德昂族人群中的基因频率（略）

　　Table 1 Gene frequency in Lisu， Pumi and Deang populations of the locus

　　表3 DXS6799位点在3个民族中的统计学数据（略）

　　Table 3 Statistics data in three populations of the locus

　　H: heterozygosity; PIC: polymorphism information content; PDF: average power of discrimination in females; PDM: average power of discrimination in males

　　表2 DXS6799位点女性的基因型频率分布（略）

　　Table 2 Genotypic frequency in Lisu， Pumi and Deang populations of the locus

　　3 讨论
　　
　　本研究对云南傈僳、普米、德昂族做了DXS6799位点的调查，发现该位点在傈僳族和普米族中有高度的遗传多态性，而德昂族由于纯合子多而不具有高度多态性，显示其在德昂人群中的法医学应用价值有限，也可能是因为抽样误差所致，有待进一步研究。DXS6799位点在傈僳族和普米族中具有很高的个人识别能力和非父排除率，显出该位点在法医学的个人识别和亲权鉴定上有较大的应用价值。在傈僳族中检出6个等位基因，男性中高频等位基因DXS6799 A11，低频等位基因DXS6799 A 8，女性中高频等位基因DXS6799 A 10，低频等位基因DXS6799 A 8、13；在普米族中检出6个等位基因，男性中高频等位基因DXS6799 A 11，低频等位基因DXS6799 A 8，女性中高频等位基因DXS6799 A 10，低频等位基因DXS6799 A 8、13；在德昂族中检出5个等位基因，男性中高频等位基因DXS6799 A 11，低频等位基因DXS6799 A 9、13，女性中高频等位基因DXS6799 A 11，低频等位基因DXS6799 A 9、13。在傈僳族女性中发现12种基因型，常见等位基因型DXS6799 A 11/12，罕见等位基因型DXS6799 A 8/10、10/13、13/13；普米族10种，常见等位基因型DXS6799 A 11/11，罕见等位基因型DXS6799 A 9/10、9/11、10/10、12/12；德昂族5种，常见等位基因型DXS6799 A 11/11，罕见等位基因型DXS6799 A 9/11、11/13。这些结果提示，X染色体新STR位点DXS6799的遗传结构存在地域、群体差异。说明建立不同地区、不同民族群体新STR位点DXS6799的遗传数据对于法医学个体识别、亲子鉴定是非常必要。再分别对该位点所有分型结果作卡方检验， 其基因型的观察值与期望值在3个群体中均吻合良好(P>0.05)，符合HardyWeinberg平衡(表2)。
　　
　　本研究首次获得了X染色体DXS6799位点的等位基因分型标准物和在傈僳、普米和德昂族中的完整基因频率数据，同时也丰富了中华民族遗传资源DNA数据库。其在其他人群中的情况，尚需进一步的工作。

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