应用流式细胞术检测17β雌二醇对H2O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的保护作用

　　　　作者：贾国荣，俞小瑞，李红波，王淑红，韩燕

【摘要】 目的 用流式细胞技术(FACS)检测h3O2诱导的视网膜神经细胞凋亡以及17β雌二醇(βE2)对细胞的保护作用。方法 取新生24h内的SD大鼠进行视网膜神经细胞的原代培养，待细胞培养4-5d，经不同因素处理后，用MTT法检测细胞存活率，用FACS法检测细胞凋亡率。结果 200μmol/L的h3O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡；低浓度的h3O2不能诱导细胞凋亡，但高浓度的h3O2诱导细胞凋亡的同时也导致了正常细胞比率的锐减；10μmol/L的βE2能有效对抗h3O2诱导的视网膜神经细胞凋亡；低浓度的βE2对细胞未表现出保护作用，高浓度的βE2对细胞反而表现出毒性作用。结论 一定浓度的βE2在一定范围内能对抗h3O2诱导的视网膜神经细胞凋亡，表现对神经细胞保护的作用。

【关键词】 17β雌二醇；h3O2；视网膜；凋亡；神经保护作用
　　
　　ABSTRACT: Objective To observe h3O2induced neuronal cell apoptosis and neuroprotection of 17βE2 by the technique of FACS. Methods The primary retina neuronal cells of neonatal SD rats which were born in 24h were cultured. After 4-5 days， we treated the cells using different factors， then observed the cell viability by MTT method and the cell apoptosis by FACS method， respectively. Results h3O2 treatment (200μmol/L) could effectively induce the cultured primary retina neuron cell apoptosis. The low concentration of h3O2 could not affect the cells， but the high concentration treatment could induce cell apoptosis， at the same time leading to normal cell decrease sharply; βE2 treatment (10μmol/L) showed neuroprotection on the primary cultured retina neuron cells， but the low concentration of βE2 had no effects， and the high concentration of βE2 manifested toxic action on the cells. Conclusion The limited concentration of βE2 shows effects of antiapoptosis and neuroprotection on the cultured primary retina cells.

　　KEY WORDS: 17βE2; h3O2; retina; apoptosis; neuroprotection

　　尽管大量的研究表明雌激素在大脑的正常发育、分化、神经功能的维持以及抗氧化、抗凋亡、抗损伤、防衰老等方面均发挥着重要的作用，但其作用的详细分子机制尚未阐明[13]。因此，有关雌激素在中枢神经系统中的作用研究已成为近年来神经科学研究的热点课题。视网膜是中枢神经系统的一部分。近20年来，许多研究均采用视网膜节细胞及视神经通路作为体内、外研究中枢神经系统损伤及再生的重要模型[45]，但有关雌激素在视网膜神经组织中的作用研究报道较少。本实验以离体原代培养的视网膜神经细胞为研究对象，用h3O2诱导凋亡，用MTT法测定细胞存活率，用FACS法测定细胞凋亡率，检测h3O2诱导凋亡的最佳浓度及雌激素的最佳保护浓度和预处理时间，为进一步研究雌激素在视网膜组织中的作用机制建立理想的研究模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器 17β雌二醇购于Sigma公司，DMEM/F12培养液购于Hyclone公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，多聚赖氨酸购于华美生物工程有限公司，h3O2购于西安试剂厂，胰酶、DMSO和MTT均购于Ameresco公司，Annexin VFITC/PI购于晶美生物工程有限公司，24孔板购于Costar公司，二氧化碳培养箱(型号为forma 3110 seriesⅡ系列)及全波长酶标仪(型号为1500)均购于Thermo Electron Corporation，流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司(型号规格为FACS Calibur)。

　　1.2 原代视网膜神经细胞的培养 取10只新生24h内的SD大鼠，用75%(体积分数)的医用酒精溺死，超净台内无菌条件下摘取眼球，解剖显微镜下剥离视网膜组织，浸泡于DMEM/F12培养液中。将获得的视网膜组织吹打呈小碎块，用2.5g/L胰酶消化10min，200目筛网过滤，1000r/min离心5min，用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，倒置显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/mL，以1000μL/孔的量接种到铺有多聚赖氨酸的24孔板内，37℃，5%(体积分数)的二氧化碳培养箱培养。每隔24h给细胞做全量换液处理，在细胞培养的第4-5天后，用于试验研究。

　　1.3 MTT法检测细胞的存活率 原代培养的视网膜神经细胞，经不同因素干预之后，24孔板各孔中培养液终体积均为1000μL。向板内的各个孔中均加入浓度为5g/L的MTT 100μL，继续在37℃、5%(体积分数)的二氧化碳培养箱中培养4h后，小心吸弃孔内的全部液体，注意不要将孔底形成的颗粒吸掉，然后每孔加入750μL的DMSO，37℃摇床振荡10min，全波长酶标仪检测490nm波长处的A值。各实验组A值除以PBS对照组A值，再乘以100%，代表各实验组细胞存活率。

　　1.4 FACS方法检测细胞的凋亡率 原代培养的视网膜神经细胞，经不同因素干预后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，用Annexin VFITC/PI双染标记细胞(按试剂盒中说明书操作)，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

　　1.5 统计学分析 每组处理因素的样本数n=3，所有实验均独立重复了3遍，实验数据均用±s表示，用统计软件SPSS 15.0 进行单因素方差分析，以P<0.05时为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度的 h3O2对原代培养的视网膜神经细胞存活率的影响 为了研究不同浓度的h3O2对原代培养的视网膜神经细胞的影响，用含血清的DMEM/F12培养液将培养了4-5d的视网膜神经细胞换为含有不同浓度h3O2的无血清DMEM/F12培养液培养24h，然后用MTT法检测细胞的存活率。结果显示(图1)：100μmol/L的h3O2处理组对细胞的存活率没有显著的影响(P>0.05)，而200μmol/L的h3O2处理组能降低细胞存活率(P<0.05)，400μmol/L的h3O2处理组能使细胞的存活率显著降低(P<0.05)。

　　图1 不同浓度的h3O2对原代培养的视网膜神经细胞存活率的影响（略）

　　Fig.1 The effects of different concentration of h3O2 on cell viability of the cultured primary retina neuronal cells

　　*P<0.05 vs. PBS group (control)

　　2.2 不同浓度的 h3O2对原代培养的视网膜神经细胞凋亡率的影响 在同样的条件下，为了进一步精确研究不同浓度的h3O2诱导视网膜神经细胞凋亡的情况，我们选用FACS法检测细胞的凋亡率。结果显示(图2)：100μmol/L的h3O2处理组使细胞的凋亡率增加了5.9%(P>0.05)；200μmol/L h3O2处理组使细胞的凋亡率增加了20.8%(P<0.05)；400μmol/L h3O2处理组使细胞凋亡率增加了32.6%(P<0.05)。然而，400μmol/L的h3O2处理组在诱导细胞发生凋亡的同时也导致了正常细胞的锐减，因此，我们选择浓度为200μmol/L的h3O2作为诱导细胞凋亡的适宜浓度来构建视网膜神经细胞凋亡模型。

　　2.3 不同浓度的βE2抵抗h3O2导致视网膜神经细胞死亡的作用 为了研究βE2抗h3O2导致细胞死亡的作用，用含血清的DMEM/F12培养液将培养了4-5d的视网膜神经细胞换为含有不同浓度βE2的无血清DMEM/F12培养液，培养30min后，加入200μmol/L的h3O2，继续培养至24h，之后用MTT法检测细胞的存活率(图3)。结果显示：单独h3O2处理组使细胞存活率降低了20%；各实验组和h3O2处理组相比较，0.1μmol/L的βE2预处理组使细胞的存活率升高了3.9%(P>0.05)；1μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率升高了8.9%(P<0.05)，10μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率升高了45.8%(P<0.05)，对细胞的保护作用最强；而50、100、200、300μmol/L以及400μmol/L的βE2预处理组使细胞存活率下降了17.8%-77.7%，显示出这5种高浓度的βE2预处理组对细胞均无保护作用，反而表现毒性作用(P<0.05)。

　　图2 不同浓度的h3O2对原代培养的视网膜神经细胞凋亡率的影响（略）

　　Fig.2 The effect of different concentration of h3O2 on the apoptotic ratio of the cultured primary retina neuron cells

　　A: ① PBS as control; ② 100μmol/L h3O2; ③ 200μmol/L h3O2; ④ 400μmol/L h3O2; B: *P<0.05 vs. control， PBS group as control

　　2.4 不同浓度βE2对h3O2诱导的视网膜神经细胞凋亡的作用 在相同条件下，为了进一步研究βE2对h3O2诱导的凋亡细胞的保护作用，我们用FACS法检测不同浓度的βE2预处理后，对抗h3O2诱导细胞凋亡的作用。结果显示：与单独的h3O2处理组相比较，3组浓度(0.1μmol/L，1μmol/L及10μmol/L)的βE2预处理30min均能使正常细胞所占比率明显增加(P<0.05，图4A)。但是，三组浓度的βE2预处理组之间，只有10μmol/L的βE2预处理30min组的正常细胞所占比率最多，细胞凋亡率最低(P<0.05，图4B)。此外，3组浓度(0.1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L)的βE2预处理60min组与单独h3O2处理组相比较，只有10μmol/L的βE2预处理组对细胞显示出保护作用(P<0.05)，而且10μmol/LβE2预处理30min和预处理60min两组对细胞的影响无显著性差别(P>0.05)。故在今后研究βE2抗神经细胞凋亡的详细分子机制过程中，拟将选择βE2的浓度为10μmol/L、预处理的时间为30min做为理想的研究条件。

　　图3 不同浓度的βE2抗h3O2导致视网膜神经细胞死亡的作用（略）

　　Fig.3 The effect of different concentration of βE2 on mortality of cultured primary retina neuron cells induced by h3O2

　　*P<0.05 vs. h3O2 group

　　3 讨论
　　
　　氧化损伤是引起神经细胞兴奋性损伤的一个主要原因，虽然有文献报道了雌激素具有对抗神经细胞凋亡的作用[67]，但有关雌激素对氧化应激诱导的视网膜神经细胞凋亡的作用报道较少。本研究以原代培养的视网膜神经细胞为研究对象，用h3O2诱导细胞凋亡，用双染标记(Annexin V/PI)的流式细胞技术检测和分析凋亡细胞。结果发现200μmol/L的h3O2能有效诱导视网膜神经细胞凋亡，成功构建了体外神经细胞凋亡模型；同时，研究发现10μmol/L的βE2预处理30min能显著地降低h3O2诱导的神经细胞凋亡，表现出明显的神经细胞保护作用。

　　图4 不同浓度的βE2对h3O2诱导的细胞凋亡的作用（略）

　　Fig.4 The effect of different concentration of βE2 on apoptotic ratio of cultured primary retina neuron cells induced by h3O2

　　A: ① PBS ; ② h3O2: 200μmol/L; ③ E2: 0. 1μmol/L (30min)+h3O2: 200μmol/L(24h); ④ E2: 1μmol/L(30min)+h3O2: 200μmol/L (24h); ⑤ E2: 10μmol/L (30min)+h3O2: 200μmol/L (24h); B: *P<0.05 vs. h3O2 group
　　
　　本研究选用新生乳鼠视网膜组织，可以排除由于年龄、环境等外界因素而导致的视网膜自发性退行性变，从而使研究模型更真实、研究结果更可靠。应用双染标记的流式细胞分析技术检测和分析结果，能定量的获得和区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞的比率。与常规检测细胞活力的MTT法相比较，结果更直观、精确、可靠；与其他两种常用的定量检测细胞凋亡的技术如：早期的PI染色法和目前的TUNEL法相比，双染标记的流式细胞分析法更具优势。早期常用的PI染色法错检率和漏检率都较高；TUNEL法的缺点是坏死细胞亦呈现TUNEL反应阳性，使其检测细胞凋亡的特异性降低[8]。此外，双染标记的流式细胞分析术不需要固定细胞，避免了PI法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失的问题，操作更省时，实验结果更可靠，更具说服力。
　　
　　本阶段的实验研究为进一步研究雌激素神经保护作用的机制奠定了坚实的基础。今后，我们将从雌激素作用的信号转导途径研究雌激素抗神经细胞凋亡的分子机制，为临床应用雌激素治疗神经退行性疾病提供治疗靶点。

参考文献

　　[1]Brann DW， Dhandapani K， Wakade C， et al. Neurotrophic and neuroprotective actions of estrogen: basic mechanisms and clinical implications [J]. Steroids， 2007， 72(5):381405.

　　[2]Deroo BJ， Korach KS. Estrogen receptors and human disease [J]. J Clin Invest， 2006， 116(3):561570.

　　[3]Manthey D， Behl C. From structural biochemistry to expression profiling: neuroprotective activities of estrogen [J]. Neuroscience， 2006， 138(3):845850.

　　[4]Golka B， LewinKowalik J， WiechSabuda E， et al， Predegenerated perpheral nerve grafts rescue retinal ganglion cells from axotomyinduced death [J]. Exp Neurol， 2001， 167(1):118125.

　　[5]Fischer D， Heiduschka P， Thanos S. Lensinjury stimulated axonal regeneration throughout the optic pathway of adult rats [J]. Exp Neurol， 2001， 172(2):257272.

　　[6]Sribnick EA， Ray SK， Nowak MW. 17beta estradiol attenuates glutamateInduced apoptosis and preserves electrophysiologic function in primary cortical neurons [J]. J Neurosci Res， 2004， 76(5):688696.

　　[7]Yao M， Nguyen TV， Pike CJ. Estrogen regulates Bclw and Bim expression: role in protection against betaamyloid peptideinduced neuronal death [J]. J Neurosci， 2007， 27(6):14221433.

　　[8]Gorczyca W， Gong JP， Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in inpidual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay [J]. Cancer Res ，1993， 53(8):19451951.