作者：唐俊利，徐海燕，刘喜平，钱民章
【摘要】 目的 研究核因子κB(NF-κB)信号通路阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胆固醇诱导的人肝细胞C反应蛋白(C-reactive protein， CRP)表达的影响。方法 培养肝细胞L-02并将其分为3个组，即胆固醇作用组、PDTC+胆固醇作用组和对照组，分别作用细胞48 h。采用Western blot和免疫比浊法分别检测细胞内和细胞培养液中CRP含量，比较有无PDTC作用下CRP表达量的变化。结果 胆固醇能显著诱导人肝细胞C反应蛋白的表达(P<0.05)，且其诱导效应随浓度增加而增强；加入PDTC阻断NF-κB信号通路后，胆固醇诱导人肝细胞CRP基因表达的作用减弱(P<0.05)。结论 PDTC阻断NF-κB信号通路后，CRP表达量下降，提示NF-κB信号通路可能参与了胆固醇诱导CRP基因表达的过程。
【关键词】 C反应蛋白；胆固醇；动脉粥样硬化；核因子κB
ABSTRACT: Objective To study the effects of PDTC on cholesterol induced C-reactive protein gene expression in L-02 cell line. Methods Human hepatocyte cell line L-02 was cultured in vitro; growth-arrested cells were pided into 3 groups， cholesterol group， PDTC+cholesterol group and control group. After 48 h incubation， western blot and immunoturbidimetry assays were carried out to detect intracellular and secreted C reactive protein expression. Results Cholesterol stimulated CRP gene expression in L-02 (P<0.05) compared with negative control group; After PDTC application， CRP gene expression in all the cholesterol dosage groups (at 6.25 mg/L， 12.5 mg/L， 25.0 mg/L， 50.0 mg/L， respectively) decreased significantly. Conclusion Cholesterol induced L-02 CRP gene expression. CRP gene expression decreased significantly after PDTC application，which indicates that NF-κB might be involved in the cholesterol induced C-reactive protein gene expression in L-02 cell line.
KEY WORDS: C reactive protein; cholesterol; atherosclerosis; nuclear factor kappa B(NF-κB)
动脉粥样硬化(atherosclerosis， As)的发病机制仍不完全清楚。脂质浸润学说认为As的发生与脂质代谢紊乱密切相关，胆固醇在As病变形成中起着重要作用，是致As的因素之一［1］。Ross教授［2］在其损伤反应学说的基础上明确提出“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”。C反应蛋白(C-reactive protein， CRP)作为一种急性期反应蛋白，其水平增高是体内炎症的敏感指标。有研究发现CRP直接参与了动脉粥样硬化的发生和发展［3-5］。近年来的研究发现，血脂水平与血清CRP水平之间有着密切的关系。Ridker等［6］报道，血清总胆固醇升高时CRP也升高；Verhamme等［7］用减低脂质含量的饲料喂养高脂血症的幼猪，4周后发现血脂和血清CRP水平都有显著降低，高胆固醇血症与血清CRP水平升高关系密切，但具体机制尚不明确。在本研究中，我们观察了胆固醇对体外培养的人肝细胞L-02 CRP基因表达的影响，并在此基础上采用核因子κB(NF-κB)信号通路的阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)作用细胞，观察NF-κB信号通路是否参与了胆固醇诱导人肝细胞CRP基因表达的过程。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
L-02细胞株由武汉大学细胞保藏中心提供。RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清、CRP免疫比浊试剂盒购自华美公司；胆固醇、PDTC购自Sigma公司；CRP标准品、IL-6等购自晶美公司；山羊抗人CRP一抗、兔抗人actin一抗购自Santa Cruz。
1.2 L-02细胞的培养
L-02细胞按常规方法培养。消化计数后以1×106个/mL的密度种于6孔板，每孔用2 mL含10%(体积分数)FBS的RPMI-1640培养基培养24 h后，换1 mL无血清RPMI-1640培养基培养24 h，后按实验分组情况对细胞进行处理。
1.3 实验分组及处理
实验分为3组：胆固醇作用组分别以6.25(ch1)、12.5(ch3)、25.0(ch3)、50.0(ch4)mg/L 的胆固醇作用人肝细胞L-02；PDTC+胆固醇作用组采用100 μmol/L PDTC预处理细胞60 min，后分别以6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L的胆固醇作用人肝细胞L-02；阳性对照使用质量浓度为50 μg/L的IL-6作用人肝细胞L-02，阴性对照组采用1% (体积分数)FBS的RPMI-1640加0.2%(体积分数)无水乙醇作用人肝细胞L-02。各组作用细胞48 h后收集细胞培养液及细胞。
1.4 Western blot检测肝细胞L-02内CRP的表达
细胞经药物作用48 h后，吸出细胞培养液，用PBS冲洗细胞，再加入细胞裂解液裂解细胞，提取胞内总蛋白，小部分用Lorry氏法测定蛋白浓度。经电泳、电转、封闭后分别与CRP及actin的一抗和二抗作用，最后采用化学发光法检测目的条带，用图像分析仪拍照并测定各显色条带的吸光度。以各组CRP/actin吸光度的比值计为CRP蛋白表达的相对含量。
1.5 免疫比浊法检测细胞培养液中CRP的含量
细胞培养液收集后，采用CRP免疫比浊试剂盒，经全自动生化分析仪进行测定。
1.6 统计学处理
采用SPSS统计分析软件处理实验数据。所得数据以均数±标准差(±s)表示，差异显著性检验用方差分析，P<0.05示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肝细胞L-02内CRP的表达情况
用相同浓度的PDTC(100 μmol/L)作用1 h，再加入不同浓度的胆固醇作用肝细胞L-02 48 h，采用Western blot检测细胞内CRP基因表达，图像分析仪分析各条带的相对灰度值。结果显示，PDTC能有效降低IL-6对L-02细胞内CRP的诱导表达，也能有效降低各浓度组胆固醇诱导的L-02细胞内CRP基因表达(P<0.05，图1)。
2.2 免疫比浊法检测细胞培养液中CRP结果
用相同浓度的PDTC(100 μmol/L)作用细胞1 h，再加入不同浓度的胆固醇作用48 h后，采用免疫比浊法检测肝细胞培养液中CRP含量，结果显示PDTC能降低胆固醇诱导的L-02 CRP基因表达(P<0.05)，与Western blot检测结果一致(表1)。表1 PDTC作用前、后L-02细胞培养液中胆固醇诱导表达的CRP的免疫浊度（略）
3 讨 论
NF-κB是普遍存在于细胞质中的以p50/p65异二聚体为主要形式的一种转录因子，与NF-κB的抑制性蛋白(inhibitor kappa B， IκB)结合而呈非活性状态。NF-κB可被一些细胞因子、蛋白激酶、氧化剂、病毒、脂多糖及紫外线刺激活化，活化的NF-κB与IκB解离后转位入核与靶基因启动子/增强子上的κB位点结合，从而调节许多靶基因的表达，被誉为控制早期基因表达的基因开关。活化的NF-κB又可诱导细胞因子、生长因子、急性蛋白、趋化因子、免疫受体和转录因子等多种物质的表达，参与炎症反应、肿瘤及动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程［8-9］。PDTC是一种抗氧化剂。研究表明该物质通过抑制IκB降解阻止NF-κB由胞质转入胞核，在体外发挥抑制NF-κB活化的作用，即PDTC可以体外阻断NF-κB信号途径［10］。Cha-Molstad等［11-12］证实NF-κB以多种方式参与CRP的表达调控。最近的研究表明，C-Rel通过与C/EBPbeta互作，以增强C/EBPbeta与CRP基因启动子区的结合，从而激活CRP的表达［12］。
Agrawal等［13］研究认为NF-κB的活化在IL-6和IL-1联合作用诱导CRP产生的过程中可能发挥了作用。本实验观察到胆固醇能诱导L-02细胞中CRP蛋白表达，提示高胆固醇血症时血清CRP升高与胆固醇诱导肝细胞CRP表达增加有密切关系。为了解这种诱导作用是否通过NF-κB信号途径，本实验用浓度为100 μmol/L的PDTC作用细胞1 h后再加入不同浓度的胆固醇作用48 h，Western blot检测细胞内CRP蛋白表达；免疫比浊法检测细胞培养液中CRP含量。结果显示，PDTC能降低但不能完全抑制胆固醇诱导的L-02 CRP的表达(P<0.05)，不仅提示NF-κB信号途径可能参与了胆固醇诱导的CRP基因表达的调控，也说明这种诱导作用可能是多种信号途径共同作用的结果。本文为探讨CRP的基因表达调控提供了新的资料，而胆固醇通过何种机制激活NF-κB信号通路，值得进一步研究。
参考文献
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