Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在移植肾急性排斥中的共同表达和意义

　　　　 作者：丁小明，薛武军，田普训，刘晓东

【摘要】 目的 检测Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B 在移植肾急性排斥时的表达水平，探讨其在急性排斥中的作用及可能的分子机制。方法 选取30例移植肾穿刺活检标本及18例正常供肾组织为研究对象，采用免疫组化方法检测Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B 的表达情况。结果 ①根据Banff97病理诊断标准，急性排斥标本30例，其中ⅠA 12例，ⅠB 11例，ⅡA 5例，ⅡB 2例；②所有组织中均可发现细胞凋亡现象，急性排斥标本中更为明显；③Bcl2在急性排斥标本中的表达水平低于正常组织(P<0.05)，与急性排斥的病理变化呈负相关(P<0.05)；Bax在两组的表达水平无差别(P>0.05)；Fas、FasL、穿孔素和粒酶B在急性排斥组中的表达水平均高于对照组，并与急性排斥的病理变化呈正相关，以FasL和粒酶B 最为明显(P<0.01)。结论 ①Bcl2在肾小管上皮细胞的表达减少提示急性排斥反应的发生；②Bax对于预测急性排斥反应的意义不大；③Bcl2、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B的表达变化均与急性排斥反应密切相关，尤以FasL和粒酶B明显，可作为监测移植肾形态学变化、功能状态以及判断预后的重要指标。

【关键词】 细胞凋亡；肾脏移植；急性排斥反应

　　ABSTRACT: Objective To detect intragraft expression of apoptotic molecules (Bcl2， Bax， Fas， FasL， Perforin and Granzyme B) during acute rejection of human renal allografts， and access the role in acute rejection. Methods Thirty tissue specimens were obtained from biopsy. The specimens were classified on the basis of the Banff criteria. Immunohistochemistry was used for detecting the expression of apoptotic molecules in the renal grafts. Results ① There were 30 acute rejection specimens: ⅠA (n=12)， ⅠB(n=11)， ⅡA(n=5)， and ⅡB (n=2). ② Apoptotic cells were found in all the samples， and more obvious during acute rejection. ③ In the acute rejection specimens， the expression of Bcl2 decreased (P<0.05). Bax was found in all the samples at a certain level， and there was no significance between the two groups (P>0.05). Fas， FasL， Perforin and Granzyme B were increased during acute rejection， and there was a correlation of the expression of FasL and Granzyme B with histological changes (P<0.01). Conclusion ① The decrease of Bcl2 of the grafts indicates that it was involved in acute renal rejection. ② Bax could not reflect the onset of acute renal rejection. ③ FasL and Granzyme are useful for monitoring the histology and function of renal allografts.

　　KEY WORDS: apoptosis; renal transplantation; acute rejection

　　尽管近年来随着器官保存、组织配型技术的发展，以及新型免疫抑制剂的广泛应用，肾移植患者的人肾短期存活率均获得了很大的提高，但远期效果并没有得到相应的改善。急性排斥反应是导致移植肾功能丧失的最主要的因素之一，但其分子机制目前尚未完全阐明。自从1995年Krams首次提出细胞凋亡是急性排斥反应可能的机制后，凋亡相关分子在急性排斥中的作用成为国内外学者的重要研究领域。凋亡相关分子在移植肾中的表达水平与急性排斥反应的发生、发展、治疗效果及移植物的功能形态变化密切相关，研究这些分子的作用机制有利于进一步降低急性排斥反应的发生率，促进临床肾移植的发展。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象及分组 实验组：1997年至2003年间肾移植术后两周内在本中心诊断为急性排斥反应的移植肾穿刺标本30例，其中男性18例，女性12例，年龄22-56岁，平均36岁；对照组：18例正常供肾作为对照。

　　1.2 组织配型 ABO血型：血型相同者20例，血型相容者10例；群体反应性抗体(PRA)：26例为阴性，另4例分别为15%、20%、30%，40%；淋巴细胞毒交叉配型试验：均为阴性(<10%)；HLA配型：HLA位点2个抗原错配4例，HLA位点3个抗原错配16例，HLA位点4个抗原错配8例，HLA位点5个抗原错配2例。

　　1.3 免疫抑制剂的应用 术前1-2d口服环孢素A(CSA)4.5-5.0mg/(kg·d)加霉酚酸酯(MMF)1.5g/d；术前口服MMF 2.0g/d、强的松(Pred)80mg；移植术中及术后1-4d应用甲基强的松龙250-750mg/d、环磷酰胺100-200mg/d冲击治疗。术后当血肌酐降至265.2μmol/L以下时开始口服CSA。术后第1天即开始口服MMF 1.5g/d，CSA起始量4.5-5mg/(kg·d)，强的松维持量10-20mg/d。

　　1.4 急性排斥的诊断和治疗

　　1.4.1 诊断标准 临床上表现有尿量减少、体重增加、发热、血压升高、移植肾区肿大和压痛；血尿素氮和肌酐持续升高，肾功能进行性下降；B超检查：移植肾体积增大，皮质増厚，回声增强，Doppler显示移植肾血液供应差、流速慢；同位素肾动态显示移植肾核素摄取及分泌、排泄相均较差；排除其他类型的排斥反应；排除CSA的肾毒性；肾间质及血管周围大量单核细胞浸润，肾小管周围淋巴细胞聚集，有血管内膜炎；移植肾病理诊断为急性排斥反应。

　　1.4.2 急性排斥反应的治疗 首先采用大剂量的甲基强的松龙、环磷酰胺冲击治疗2-3d。甲基强的松龙冲击治疗无效时改用抗CD3单克隆抗体(OKT3)或者抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)。抗排斥治疗时间7-10d，待排斥反应逆转后恢复三联免疫抑制方案。肾血管扩张药物的应用：①利尿合剂的使用：盐酸多巴胺20mg、盐酸酚妥拉明10mg、速尿20-80mg、654-2 10mg，加入50g/L(5%)葡萄糖注射液500mL中静脉点滴，每日1-3次；②盐酸川穹嗪120mg加入50g/L(5%)葡萄糖注射液或生理盐水250-500mL中静脉点滴，每日1次。这两种液体持续应用至肾功能恢复正常。

　　1.5 主要试剂 鼠抗人Bcl2单抗(IgG1)、鼠抗人Bax单抗(IgG2b)、兔抗人FAS多抗(IgG)、兔抗人FASL多抗(IgG)均为美国Santa Cruz公司产品；鼠抗人穿孔素单抗(IgG)为深圳晶美生物公司产品；鼠抗人粒酶B单抗(IgG2a)，免疫组化SP染色试剂盒、DAB显色试剂盒、中性树胶均为北京中山生物技术公司产品。

　　1.6 实验方法

　　1.6.1 常规病理技术 移植肾穿刺标本立即放入新鲜配制的10%(体积分数)甲醛溶液中固定，12h后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察移植肾组织中主要的凋亡细胞类型。所有组织均先按Banff 97分类标准进行诊断。

　　1.6.2 免疫组化染色 严格按照SP染色试剂盒说明书进行，实验中每种指标均设置阳性和空白对照(以PBS代替一抗)。免疫组化染色以出现明显棕黄色即为阳性结果，若DAB显色15min组织仍无着色则为阴性结果。所检测蛋白表达半定量：：50%以上的肾小管呈阳性表达；：25%-50%的肾小管呈阳性表达；+：25%以下的肾小管呈阳性表达。

　　1.7 统计学处理 用Wilcoxon两样本比较法进行统计分析，用Spearman等级相关分析。统计分析利用SPSS10.0软件进行，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Banff 97诊断分类[1] 急性排斥反应组中，ⅠA(明显的间质浸润，即25%以上实质受累；中度小管炎病灶，即>4个单核细胞/每小管横断面或10个小管细胞)占40%，ⅠB(明显的间质浸润；严重小管炎病灶，即>10个单核细胞/每小管横断面或10个小管细胞)36.6%，ⅡA(轻度到中度动脉内膜炎)16.6%，ⅡB(严重动脉内膜炎，管腔狭窄25%以上)6.6%。

　　2.2 移植肾组织中的细胞凋亡 HE染色可见，凋亡细胞的核呈蓝黑色，胞浆为淡红色，单个散在地分布在组织中。表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等，可发现凋亡小体。依常见顺序排列为肾小管上皮细胞、炎细胞、动脉壁平滑肌细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞、移行上皮细胞。肾小管上皮细胞凋亡可与核分裂相伴出现，细胞核碎裂细胞趋向腔面或脱落于管腔中，主要见于近曲小管和直小管，集合小管相对少见。炎细胞凋亡主要为淋巴细胞和中性白细胞，见于肾间质或小血管腔内，多为凋亡小体。浆细胞凋亡时胞浆红染、固缩，核碎片3-5个。其他类型细胞凋亡主要表现为核碎裂。本实验中所有的标本均可发现凋亡细胞，但以急性排斥标本中的凋亡细胞数目最多，形态学特征也更为典型。

　　2.3 移植肾组织中Bcl2/Bax蛋白的表达 Bcl2 表达的阳性定位为胞浆及胞膜有棕黄色颗粒。按阳性程度，依次为：肾小管上皮细胞(近曲小管为著)、移行上皮细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮和间质中单核淋巴细胞。在对照组中的表达以()为主(42.1%)，急性排斥标本则多为(+)(51.1%)，组间比较有统计学意义(P<0.05)，并且与组织病理变化呈负相关(r＝-0.286，P=0.026)。Bax蛋白在所有标本中均有广泛的表达，定位于细胞浆，以()-()为主，两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。

　　2.4 移植肾组织中穿孔素/颗粒酶B的表达 100%急性排斥反应的移植肾病理标本均表达穿孔素和粒酶B，二者的表达情况类似，主要定位于肾小管上皮细胞和间质淋巴细胞的胞浆和胞膜。急性排斥组主要为()-()(分别为68%和70.2%)；正常对照组主要为(+)(分别为57.9%和63.2%)。组间比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，穿孔素和粒酶B的表达与病理分级呈正相关，以粒酶B的相关程度较好(r＝0.356，P<0.01)。

　　2.5 Fas/FasL的表达 Fas抗原的表达定位于细胞浆和细胞膜，主要为肾小管上皮细胞(近曲小管为著)，偶见于间质浸润的单核及淋巴细胞。在急性排斥组标本中的表达明显高于对照组(P<0.05)。FasL则在肾小管上皮细胞和间质淋巴细胞均可发现表达，急性排斥组较正常对照组表达明显，有极显著的差异(P<0.01)。Fas和FasL的表达与病理分级均呈正相关，尤其以FasL的相关程度最高(r＝0.368，P<0.01)。

　　3 讨论
　　
　　许多大型移植中心的回顾性研究表明，急性排斥反应是发生慢性排斥反应的重要危险因素。Galante等[2]对1544名患者进行随访分析后发现，非急性排斥组移植物5年存活率为82.2%，而急性排斥组为62.4%(P<0.001)，同时慢性移植肾病的发生率分别为7.6%和22.9%。因此，对移植肾急性排斥反应的准确而及时的诊断，对于病情的控制和判断预后十分重要。
　　
　　有研究证实，急性排斥反应是一种复杂的免疫机制所导致的炎性损伤过程，由细胞免疫和体液免疫共同参与，但细胞免疫发挥更为关键的作用。临床上约90%急性排斥反应以细胞免疫介导为主，称为急性细胞型排斥反应。其病理形态学的特征为明显的间质炎性细胞浸润，炎性细胞主要为CTL，伴有程度不等活化的的NK细胞、巨噬细胞等，通过破坏肾小管基底膜累及肾小管上皮细胞，引起肾小管炎，导致肾小管上皮细胞肿胀、坏死，损伤移植物功能。因此，CTL是引起急性排斥反应并导致移植肾损伤的最主要的环节。CTL对靶细胞的杀伤主要有两种方式，即攻击靶细胞膜和攻击靶细胞核，分别通过诱发靶细胞溶解性坏死和细胞程序性死亡(PCD)而实现的。
　　
　　在本研究中，通过光镜观察到移植肾组织中存在广泛的细胞凋亡现象，并尤其以急性排斥标本中多见，对缺血缺氧极为敏感的近曲小管上皮细胞是重要的凋亡细胞类型。说明了肾小管上皮细胞是急性排斥时淋巴细胞攻击的主要靶细胞，细胞凋亡与急性排斥反应中淋巴细胞介导的移植物损伤密切相关；同时也提示我们监测移植肾中细胞凋亡的变化对急性排斥的病情有一定的指导意义。Matsuno等[3]也有类似的发现，他利用抗BM1抗体特异地识别凋亡细胞，发现急性排斥反应病变中显示不同程度的阳性表达；相比之下，肾功能稳定者，未见BM1阳性染色细胞。研究结果表明，肾小管上皮细胞凋亡在移植肾急性肾功能不全中起了重要作用。此外，在研究中我们还观察到急性排斥标本中浸润的淋巴细胞也有不同程度的凋亡现象。这可能是由于临床诊断急性排斥反应后给予激素冲击等治疗所导致的。August等[4]发现，病理活检证实为急性排斥的患者中，在给予激素冲击治疗后，移植肾组织中浸润的淋巴细胞凋亡明显增加，并且淋巴细胞的凋亡预示患者病情转归良好。此结论与我们的观察结果相似。
　　
　　目前研究发现，多种凋亡调控基因及相关分子参与了急性排斥中CTL杀伤靶细胞的过程。但是，其具体机制仍未完全阐明。一般认为的途径主要为两种：一是Fas/FasL介导的细胞凋亡途径；另一种是穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒途径[5]。本研究结果表明，急性排斥标本中Fas、FasL、穿孔素和粒酶B 的表达水平均高于正常对照组(P<0.05)，并且与急性排斥反应的病理分级呈正相关，以FasL和粒酶B的表达最为明显。说明Fas/FasL和穿孔素/粒酶B途径均参与了急性排斥CTL介导的肾小管上皮细胞凋亡，提示它们的表达水平变化可准确地反映移植肾的损伤情况，可用于急性排斥病情的诊断和预后判断。
　　
　　研究表明[67]，Bcl2蛋白可抑制多种因素引起的细胞凋亡，显著延长细胞生命。表达Bcl2基因的上皮细胞具有生存能力，而失去Bcl2基因表达能力的上皮细胞则注定要凋亡。Bax是一种Bcl2相关蛋白，具有对抗Bcl2蛋白抑制凋亡的作用。当凋亡发生时，Bax蛋白可从细胞浆转移到线粒体并与线粒体膜相结合，通过自身或与其他Bcl2家族成员形成的同型和异型二聚体促进细胞发生凋亡。体外实验表明，在调节细胞凋亡的过程中，Bcl2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[8]。本实验结果表明，急性排斥组标本中Bcl2在肾小管上皮细胞的表达较正常对照组明显下降(P<0.05)，Bax的表达在两组中虽然无差异，但Bcl2/Bax的比值下降了，反映了移植肾上皮细胞的凋亡，提示Bcl2和Bax参与了CTL损伤肾小管上皮细胞的过程。此外，Bcl2在移植肾中的表达水平与移植肾急性排斥反应病理变化呈负相关(P<0.05)，可一定程度反映移植物的损伤情况。由于Fas系统和穿孔素是CTL发挥细胞毒作用的起始环节，Bcl2作用位点可能在穿孔素和(或)Fas系统介导的细胞凋亡途径的下游。
　　
　　综上所述，细胞凋亡是急性排斥反应时移植物损伤的重要机制之一，与排斥反应的发生、发展和移植物的功能变化密切相关。Bcl2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B均参与了移植肾急性排斥时CTL介导的肾小管上皮细胞损伤，它们在移植肾中的表达变化提示了急性排斥反应的发生，FasL和粒酶B可作为监测移植肾形态学变化、功能状态以及预后判断的重要指标，Bcl2则从属于Fas系统和穿孔素介导的细胞凋亡过程。

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