两种方法冻存胎儿卵巢组织后的活力判断

【摘要】 目的 比较常规慢速冻存法与快速冻存法保存胎儿卵巢组织的效果，为快速冻存法的应用提供依据。方法 以1.5mol/L乙二醇与0.1mol/L蔗糖作冷冻保护剂，分别采用常规慢速冻存法和三步快速冻存法保存1mm3大小的胎儿卵巢组织，解冻后观察两组卵巢组织内的超微结构；以去势裸鼠为受体，将解冻后的胎儿卵巢皮质片移植于裸鼠的双肾被膜下，观察移植2周和8周后移植物的组织学结构、移植物存活率、卵泡密度及受体鼠血清E2水平。结果 与新鲜胎儿卵巢组织相比，慢速和快速冷冻后卵巢组织中形态正常的卵母细胞的比例都明显减少(P<0.05)。移植后2周的两移植组均有卵泡存活，原始卵泡广泛分布于基质中；移植后8周的两移植组的卵泡数量都明显减少，但初级卵泡的数量相对增加。比较移植2周和8周后移植物的存活率、单位面积移植物内的原始卵泡或初级卵泡数及受体鼠血清雌激素水平，两移植组并无显著性差异。结论 三步快速冻存法可有效保存胎儿卵巢组织的生物活性，解冻后卵巢组织的形态学结构、雌激素分泌与常规慢速冻存组并无显著性差异。

【关键词】 胎儿 卵巢 深低温冻存 移植

　　ABSTRACT: Objective To compare the effects of slowrate freezing method with that of rapid freezing method for cryopreservation of fetal ovarian tissue on viability of ovarian tissue and provide some data for the application of rapid freezing method. Methods Human fetal ovarian slices (1mm3 in size) were frozen with conventional slow cooling method and threestep rapid freezing method， respectively， using freezing solution containing 1.5mol/L ethylene glycol and 0.1mol/L sucrose. After thawed， electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes in ovarian tissue. Ovariectomized female nude mice were chosen as recipients， two fetal ovarian tissue slices were separately inserted under kidney capsule of two sides in each mouse. The survival of ovarian grafts， histological structure， follicular density and serum E2 levels in recipients were detected after transplantation for two or eight weeks. Results Compared with that of fresh ovarian tissue， the number of oocytes with normal morphology in slow and rapid freezing groups was significantly decreased (P<0.05). Two weeks after transplantation， numerous follicles were found in both groups and primordial follicles were widely dispersed in the stroma. Eight weeks after transplantation， the number of follicles in both groups was reduced， but the number of primary follicles was relatively increased. There were no significant differences in the survival rate of ovarian grafts， follicular density and serum E2 level between the two groups. Conclusion The viability of fetal ovarian tissue can be well preserved by threestep rapidfreezing method and there are no differences in morphology and estrogen secretion of ovarian tissue after thawed， compared with the conventional slow freezing method.

　　KEY WORDS: fetus; ovary; cryopreservation; transplantation

　　卵巢早衰或病理性卵巢切除导致机体内分泌失调，给女性的身心健康带来严重影响。针对这类患者，采用激素替代疗法(hormone replacement therapy， HRT)进行药物治疗已应用多年。然而，有研究显示HRT可增加女性罹患子宫内膜癌及乳腺癌的风险性[13]，这使其应用受到了限制。事实上，卵巢激素并非只有雌激素、孕激素和雄激素，还有许多生物调节因子。卵巢移植可为机体提供均衡的生理所需活性物质，从而缓解卵巢激素撤退引发的一系列疾病。卵巢组织的冻存为卵巢移植提供了方便，然而异体卵巢移植面临的供体器官严重短缺及排异反应成为其应用中的主要障碍[4]。为了解决这些问题，研究者们把目光投向了胚胎器官。胚胎卵巢作为供体有以下几方面的优势：①胚胎组织的抗原性较成体弱，可降低移植后的排异反应[5]；②胚胎卵巢内含有大量的原始卵泡使其比成体卵巢更耐受缺血、缺氧过程[6]，适于冷冻与移植；③近年来已有学者证实，冻存可降低组织的免疫原性[7]。
　　
　　鼠类与人类胚胎卵巢的冻存已有文献报道。但是，在冷冻方法上多采用慢速冻存法。该法虽然效果稳定，但昂贵的冷冻设备使其不易在一些小型实验室与生殖中心推广应用。因此，探索一种胎儿卵巢组织的快速冻存方法将有助于卵巢组织库的建立。在前期实验中，我们报道了快速冻存法能够有效地保存新生大鼠的卵巢组织，在冻融移植后卵巢组织的免疫原性被进一步降低[8]。但是，这种方法是否可应用于人类胎儿卵巢组织的冻存？冻融移植后胎儿卵巢组织的发育与内分泌功能又如何？文献关于这方面的报道还很少。本研究的目的是比较常规慢速冻存法与快速冻存法对解冻后胎儿卵巢组织的超微结构及移植后组织生长活力的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源及实验动物 本研究获宁夏医学伦理委员会批准及母亲与家属的同意。取24-28周引产的胎儿8例，于娩出后无菌条件下即刻取出双侧卵巢，经生理盐水洗涤后，置于预冷的含200mL/L小牛血清的PBS中。体视镜下，去除卵巢髓质后将胎儿卵巢皮质分切成1mm3大小的组织块备用。BALB/cnu/nu雌性裸鼠，品系合格证号：医动字第13-203号，6-8周龄，体重18-20g，由宁夏医学院实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂配制 冷冻保护液分为A液和B液。A液为1.5mol/L乙二醇+含200mL/L小牛血清的PBS；B液为1.5mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖+含200mL/L小牛血清的PBS。解冻液(C液)为0.5mol/L蔗糖+200mL/L小牛血清的PBS液。

　　1.2.2 冷冻容器 采用直径0.5cm、长8cm的塑料麦管作冷冻管，该管中装有B液和C液，两液间用约40μL的气泡隔开；冷平衡在自制的液氮蒸气槽中进行。

　　1.2.3 快速冻存法 卵巢皮质片置于A液，4℃渗透平衡30min后，再置于B液，4℃继续渗透平衡30min，移入含有B液的0.5mL麦管中。麦管在液氮蒸汽浴槽(≤-120℃)中冷平衡5min后迅速投入液氮保存。

　　1.2.4 慢速冻存法 卵巢皮质片置于A液，4℃渗透平衡5min，置于含有1mL B液的冻存管(1.8mL Nunc)，4℃继续渗透平衡30min后，在程序冷冻仪内慢速降温：以2℃/min速率从4℃降至-8℃，-8℃手动植冰，0.3℃/min降至-40℃、-30℃/min降至-150℃，投入液氮。

　　1.2.5 解冻方法 冻存1-7d后，从液氮中取出麦管和冻存管，置于37℃的水浴中复温1min，使卵巢组织块连同B液、C液一起流入表面皿中，37℃温箱放置30min；将组织块移入含200mL/L小牛血清的PBS液中(4mL)，于37℃温箱中孵育30min，充分晃动，中间换液1次，以洗脱冷冻保护剂。

　　1.2.6 电镜观察 解冻后部分胎儿卵巢组织经常规电镜标本制作方法制片。置H600透射电镜下观察有无超微结构的损伤，并以卵母细胞膜结构的完整性与胞浆内≤10%(面积比)的空泡作为衡量冷冻后卵母细胞形态正常的两个指标[9]，计算正常形态卵母细胞的百分比，判断冷冻保存效果。

　　1.2.7 卵巢移植 实验动物随机分为以下几组：假手术组(group 1， n=6)；去势对照组(group 2， n=6)；快速冷冻移植组(group 3， n=12)与慢速冷冻移植组(group 4， n=14)。在手术过程中，group 1暴露卵巢后不接受进一步处理，缝合创口。Group 2-4切除裸鼠自身双侧卵巢，group 2不做进一步处理，缝合创口。在group 3和4中，暴露裸鼠双侧肾脏，用显微手术镊轻提肾被膜，在其上极剪一小口将冻融的胎儿卵巢皮质片迅速塞入肾被膜下并轻推至肾脏下方，双侧移植完毕依次缝合切口。

　　1.2.8 光镜观察 分别于移植后2周和8周取材，Bouin固定，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色。在Olympus显微镜下观察卵泡的形态学改变，并随机选取10个高倍视野(400×，0.1885mm2/视野)计数单位面积中的卵泡数。

　　1.2.9 雌激素的测定 分别于移植后2周和8周处死动物，经心脏穿刺取血，2500r/min离心15min，取上清液(即血清)，采用双抗体放射免疫法测定雌激素含量。放射免疫试剂盒来自北京北方生物技术研究所，仪器为西安二六二厂生产的γ放射免疫计数器。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件对各组实验数据进行分析。移植物存活率的比较采用χ2检验；4组之间血清E2水平的比较采用方差分析，P<0.05认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 冻融后卵巢超微结构的观察 新鲜胚胎卵巢组织内，卵母细胞及卵泡细胞核膜清晰完整，核仁明显，内质网、线粒体等细胞器散在分布，同时胞质内还含有少量的空泡(图1A)。与新鲜卵巢组织相比，慢速或快速冷冻后胚胎卵巢组织中形态正常的卵母细胞的比例都明显减少(P<0.05)，新鲜组织中约占82%，慢速冷冻组织中约占61%，快速冷冻组织中约占52%。慢速冷冻能够减少大部分卵泡的冷冻损伤，但仍有部分卵泡在冷冻后形态发生明显改变，卵母细胞的核膜不完整，线粒体肿胀，胞质内有多量的小囊或小泡(图1B)。快速冷冻后除了结构完整的卵泡外，也可见到部分卵泡的细胞核膜不完整、胞质内线粒体肿胀，嵴消失，胞质内有多量的空泡(图1C与图1D)。

　　图1 新鲜及冻融胎儿卵巢组织的超微结构（略）

　　Fig.1 The ultrastructure of fresh and frozenthawed fetal ovarian tissues

　　A: Fresh ovarian tissue (×5000); B: Slow freezing group (×4000); C: Rapid freezing group (×4000;) D: Rapid freezing group (×15000). Flattened follicle cells (f) surround the oocyte (o). In the oocyte， there are recognizable mitochondria (m)， which are grouped near the nucleus (n). Black“↑”shows that the intact nuclear membrane is destroyed after frozenthawed. White“↑”shows many vacuoles in the cytoplasm

　　2.2 移植后卵巢的组织学观察 取材时肉眼可见移植物生长于肾被膜下(图2A与图2B)。部分受体鼠肾被膜下没有发现移植物或仅残留一浅薄的白色组织痕迹，可能是移植物没有与移植部位建立血管联系而被吸收的缘故。移植前，胚胎卵巢组织内有大量的原始卵泡。移植后2周的两移植组均有卵泡存活，原始卵泡广泛分布于基质中。移植物内有较多的新生血管，基质细胞正常存活，没有坏死征象(图2C与图2D)。移植后8周的移植物内的卵泡数量明显减少，但卵泡体积明显增大，个别卵泡的卵泡细胞呈立方形并且数目增多(图2E与图2F)；另外，与移植后2周的初级卵泡与原始卵泡的比例相比，移植后8周的初级卵泡的相对数量明显增加(快速冻存组：18.7/70.8 vs. 11.9/30.6，慢速冻存组：22.6/83.1 vs. 13.1/33.9，P<0.05)。比较移植2周和8周后移植物的存活率及单位面积移植物内的原始卵泡和初级卵泡数，两移植组并无显著性差异(表1与表2)。

　　2.3 移植后受体鼠的雌激素的测定 移植2周后，两移植组受体鼠血清雌激素虽明显低于假手术组(14.1±2.3ng/L， P<0.05)，但均明显高于去势对照组(1.4±0.4ng/L， P<0.01)。移植8周后，两移植组受体鼠血清雌激素含量显著降低，但两组间的差异不显著(表1与表2)。

　　表1 移植2周后移植物存活率、卵泡密度及血清E2水平的测定（略）

　　Table 1 Survival of ovarian grafts， follicular density and serum E2 level at two weeks after transplantation

　　表2 移植8周后移植物存活率、卵泡密度及血清E2水平的测定（略）

　　Table 2 Survival of ovarian grafts， follicular density and serum E2 level at eight weeks after transplantation

　　图2 冻融胎儿卵巢移植的组织学结构（略）

　　Fig.2 The histologic structure of frozenthawed fetal ovarian tissue

　　A and C: two weeks after transplantation in rapid freezing group， C: HE×200; B and E: eight weeks after transplantation in rapid freezing group， E: HE×400; D: two weeks after transplantation in slow freezing group， HE×200; F: eight weeks after transplantation in slow freezing group， HE×400

　　3 讨论
　　
　　卵巢冷冻及移植作为维持女性生殖内分泌功能的一项技术而受到很多学者的关注。目前，关于成体卵巢组织的冷冻及解冻后卵泡发育研究已有多方面的报道。快速冷冻法是一种简单、廉价且有效的冻存方法。研究表明这种方法冻存的卵母细胞及胚胎，解冻后有较高的存活率[1013]。但是，用这种方法来保存胚胎卵巢组织的研究还很少。
　　
　　在本研究中，我们观察了用快速冻存法保存的胎儿卵巢组织在解冻后的超微结构及移植后的组织活力；并通过超微结构、移植物的组织学结构、移植物存活率、卵泡密度及受体鼠血清E2水平，五个方面比较快速冻存与常规慢速冻存的保存效果差异，结果显示快速冻存组移植物内的卵泡存活、发育与慢速冻存组并无显著性差异。分析原因可能有以下几点：首先是冷冻前的充分脱水。在冷冻过程中的充分脱水常常是一个重要的保护性措施。细胞与组织的充分脱水有利于避免冷冻损伤。在快速冻存中我们采用三步脱水法，前两步在4℃下脱水30min，最后一步在液氮蒸汽浴槽中(温度低于-120℃)继续低温脱水5min。在快速冻存过程中伴随降温的进一步脱水可阻止细胞内冰晶的形成。同时，4℃下的脱水温度还有利于减少冷冻保护剂的毒性。其次，选择合适大小的组织冻存。在降温过程中，热量通过对流进行传递，热量的传递速率与组织内细胞的相对密集程度、组织块的大小相关。组织内细胞越密集或组织块越大，热量通过热梯度跨越细胞传递得越慢，不利于组织降温。同时，细胞密集程度与组织块的大小也直接影响冷冻保护剂向组织中心部位的渗透。在我们以前的研究中也发现适宜快速冻存的卵巢组织块大小为1mm3左右。第三，可能是胚胎卵巢比成体卵巢更耐受冷冻。胚胎卵巢在组织结构上较成体卵巢柔韧，有利于冷冻保护剂的渗透。另外，胚胎卵巢内含有大量的原始卵泡，这些卵泡处于减数分裂的休眠期，对低温的敏感性比次级卵泡或成熟卵泡要低。
　　
　　关于新鲜与冻融鼠胚卵巢的移植研究显示鼠胚卵巢在移植后有一个加速成熟期。新鲜鼠胚卵巢移植14-21d后，在移植物内即可见到窦卵泡并可检测到雌激素分泌[14]，而冻融后的新生大鼠胚胎卵巢在移植40-45d后，移植物内也可见处于不同发育阶段的生长卵泡、间质腺及闭锁卵泡[8]。在本研究中值得注意的是，人类胚胎卵巢移植后并没有类似的上述变化，移植8周后可见到移植物中有较多的初级卵泡，没有发现窦卵泡。表明人类胚胎卵巢移植后卵泡发育可能需要更长的时间，另一个可能的原因是去势成年受体鼠血循环中的促性腺激素浓度不足以充分启动卵泡发育。
　　
　　总之，采用三步快速冻存法解冻后的胎儿卵巢组织在形态学、移植后的存活、发育、激素分泌等方面，与常规慢速冷冻法相比并无显著性差异。快速冻存法具有简单、经济、有效的特点。本研究为快速冻存法在胚胎卵巢组织冻存中的应用提供了依据。但是，我们的研究仍然只是初步的，还需要进一步研究在采用快速冻存法时如何减少组织的缺血损伤、加速移植后卵泡的发育与内分泌功能。
　　

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