DXS8378基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性

【摘要】 目的 采用分子克隆技术制备X染色体DXS8378位点等位基因分型标准物，了解该STR位点在中国云南傈僳、普米、德昂三个群体的遗传多态性及其法医学应用价值。方法 用PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离各等位基因片段，回收纯化后进行二次扩增，分别插入到pGEMT Easy质粒载体中，DNA测序证实插入片段的大小和结构，等位基因片段按国际标准进行命名后，经转化、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出该位点的等位基因分型标准物，进行群体遗传学研究。结果 得到DXS8378位点分型标准物，应用此分型标准物研究中国云南傈僳、普米、德昂族人群中基因型分布频率。结论 该法制备的STR位点等位基因分型标准物适用于法医学鉴定实践，具有较高的应用价值，适合于群体遗传学的分析。

【关键词】 分型标准物 短串联重复序列 重组质粒 遗传多态性 DXS8378

　　ABSTRACT: Objective To investigate the genetic polymorphism of DXS8378 STR locus of chromosome X in Chinese Lisu， Pumi and Deang populations in Yunnan and construct relative standard allelic ladders. Methods After being amplified by PCR， different STR allelic fragments were isolated from the PAG electrophoresis. The STR allelic fragments were extracted by kit and reamplified by PCR to obtain purified allelic fragments. Next， the purified allelic fragments were subcloned inpidually into the PUC plasmid vectors， and the size and structure of the inserts were confirmed by the analysis of their DNA sequences. Then we transfected it into competent E.coli DH5αTM cells， and finally， the recombinant plasmids DNA with the inserts were used as template for reamplification to generate the standard ladders. Results The standard allelic ladder for DXS8378 locus was obtained， with which the genetic polymorphisms of DXS8378 locus in three Chinese populations in Yunnan were studied. Conclusion The standard ladder made by this method is excellent， and DXS8378 is powerful for forensic practice in Chinese population.

　　KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeat; recombined plasmid; genetic polymorphism; DXS8378

　　人类X染色体由于其独特的遗传方式[1]，在X染色体连锁遗传病的基因定位、遗传病的基因诊断和法医学的性别鉴定等多方面具有重要的价值。两个多态信息含量(polymorphism information content， PIC)相当的STR位点作比较时，X染色体上的STR位点的平均排除率(mean exclusion chance， MEC)比常染色体上的位点要高的多。因此，在姐妹认定和女性的父权鉴定等法医学领域中，X染色体特异性的STR有重要的应用价值[24]。
　　
　　用PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析STR基因座时，分型是依据谱带的位置，而采用分子克隆技术制备大量优质的等位基因分型标准物，既可以提高分型的准确性，又可以增加实验结果间的可比性。目前，分型标准物主要依靠国外几家试剂大公司提供，其价格昂贵，对于新发现的STR位点，其分型标准物在市场上也无法购得。同时，一些在中国群体中识别机率和非父排除概率高的STR位点的分型标准物不能提供[56]。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外首先制备出DXS8378位点的STR分型标准物。应用自制的分型标准物，首次调查了中国云南地区傈僳、普米[7]、德昂族群体中的DXS8378基因型分布频率，对其在法医学中的应用价值进行评价，对实现以此技术为基础的STR分型标准物的标准化、国产化进行了探索[8]。

　　1 材料与方法

　　1.1 样本与引物 遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区93名普米族(其中女性37名)、95名傈僳族(其中女性38名)和83名德昂族(其中女性38名)群体中无亲缘关系个体的静脉血，EDTA抗凝，-20℃保存。引物序列查自GenBank，分别为F：CAC AGG AGG TTT GAC CTG TT；R：AAC TGA GAT GGT GCC ACT GA，由奥科公司合成。

　　1.2 试剂与仪器 2×Taq polymerase mix和DH5α感受态细胞(天为时代公司)；pGEMT EasyVector SystemⅠ(美国Promega公司)；聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司)；EDTA等其余试剂均为国产分析纯。台式高速离心机(德国Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000μL)(法国Gilson公司)；三相恒压电泳仪(美国BiaRad公司)；干热器(美国Bellco公司)；旋涡混匀器(日本Tomy kogyo公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂)；低温冰箱(-30℃，-70℃)(日本Sanyo公司)；ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。

　　1.3 制备标准分型物模板DNA 通过Chelex法提取云南普米族、傈僳族和德昂族群体样本DNA，PCR扩增，反应体系：总体积13μL，2×Taq polymerase mix 6μL，引物1μL(5nmol/L)，DNA 2μL，h3O 2μL。反应条件为：变性94℃ 30S， 退火61℃ 45S，延伸72℃ 60S，共30个循环。
　　
　　用60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度5%)电泳分离PCR扩增产物，银染显色。从群体样本的扩增产物中，选出了5个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断，制备成PCR再扩增的模板。

　　1.4 PCR再扩增、产物鉴定与纯化 将制备好的5份DNA进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。

　　1.5 PCR产物的克隆 采用pGEMT Easy Vector SystemⅠ克隆试剂盒，将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5α感受态细胞，选择培养筛选，再用以上的扩增方法选出含有正确插入片段的克隆。

　　1.6 重组质粒的DNA测序 采用ABI3730全自动遗传分析仪，以质粒公用的M13正反引物对重组质粒的插入片段进行双向循环测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(International Society of Forensic Haemogenetics， ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名[9]。

　　1.7 重组质粒的扩大培养与保存 对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养、纯化后，得到该基因座的等位基因分型标准参照物重组质粒。-20℃保存。

　　1.8 等位基因分型标准物的制备和再鉴定 用含该基因座等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系及条件如前。纯化各基因座各等位基因的PCR产物，混合制备成等位基因分型标准物阶梯，通过60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得标准分型物的可用性。

　　1.9 数据分析 利用SPSS12.0统计学软件计算各基因座等位基因片段的频率和基因型频率。利用χ2检验进行HardyWeinberg平衡吻合性检验。根据100名普米族、98名傈僳族、83名德昂族无关个体该基因座的等位基因和等位基因型，分别计算杂合度(heterozygosity， H)、个人识别率(power of discrimination， PD)、多态信息量(polymorphism information content， PIC)。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒插入片段的序列分析及DXS8378的阶梯状分型标准物的制备 用ABI3730测序结果分析，得知DXS8378的5个插入片段是以四核苷酸CTAT为核心序列重复9-13次，其长度为199-215bp，与GenBank中公布的数据完全一致。根据ISFH规定的命名原则，插入片段的几个等位基因分别命名为9-13。用分子克隆技术制备等位基因的阶梯状分型标准物(图1)。

　　2.2 分子克隆制备的DXS8378基因座分型标准物应用于群体研究的结果 将制备的DXS8378阶梯状分型标准物用于云南地区普米族、傈僳族、德昂族群体，分别检出5种等位基因以及11种不同的基因型，等位基因频率分布范围为0.132-0.649。基因型频率范围为0.026-0.450，各基因座的具体遗传学和法医学信息见表1至表4。

　　图1 DXS8378等位基因分型标准参照物的电泳分型结果（略）

　　Fig.1 The electropherotyping results of DXS8378 allelic ladder

　　M: the mixture of DXS8378 allelic ladder; M: DXS8378 allelic ladder; 1-5: the fragments amplified by recombinant plasmid; 1-5 the repeat structure (ctat) range from 9-13

　　表1 DXS8378位点在傈僳族、普米族和德昂族人群中的基因频率分布（略）

　　Table 1 Distribution of allelic frequencies for DXS8378 locus in Chinese Lisu， Pumi and Deang populations in Yunnan

　　表2 DXS8378基因座女性的基因型频率分布（略）

　　Table 2 The distribution of genotypes for DXS8378 locus in Chinese Lisu， Pumi and Deang female populations in Yunnan

　　表3 女性基因型分布的HardyWeiberg平衡定律检验（略）

　　Table 3 Test for HardyWeinberg equilibrium of distribution of female genotypes

　　表4 DXS8378基因座在5个民族中的统计学数据（略）

　　Table 4 Statistical data of DXS8378 in five populations of the locus

　　H: heterozygosity; PIC: polymorphism information content; PDF: power of discrimination in females; PDM: power of discrimination in males; PE: power of exclusion

　　3 讨论
　　
　　只有具备了一套精确的国际标准化命名的标准参照物，才有可能对STR分型结果做出正确的分型和命名。我们采用分子克隆技术，在国内首先制备出精确的DXS8378基因座的5个等位基因标准片段，通过测序后又按国际命名原则进行了命名，得到了可以大量复制的DXS8378等位基因分型标准参照物，为该位点分型技术标准化及DNA数据库的建立奠定了基础。
　　
　　在傈僳族群体中，共发现了5个等位基因和6个基因型。其中，在女性中，等位基因10最常见(频率为0.613)，在男性中，等位基因10最常见(频率为0.649)。基因型10/10最常见(频率为0.450)。
　　
　　在普米族群体中， 共发现了5个等位基因和8个基因型。其中，在女性中，等位基因10最常见(频率为0.513)，在男性中，等位基因10最常见(频率为0.491)。基因型10/11最常见(频率为0.421)。
　　
　　在德昂族群体中，共发现了3个等位基因和6个基因型。其中，在女性中，等位基因10最常见(频率为0.408)，在男性中，等位基因10最常见(频率为0.467)。基因型10/11最常见(频率为0.263)。
　　
　　对每个群体的基因型进行Fisher确切概率计算法计算后，可以检测其是否符合HardyWeinberg平衡(表3)。DXS8378位点在三个中国群体中均符合HardyWeinberg平衡(P均&>0.05)。三个中国群体中的期望排除机率在0.188-0.404之间，女性识别效能在0.758-0.808之间(表4)。
　　
　　χ2检验比较DXS8378位点在三个群体女性的等位基因频率分布，结果提示德昂和傈僳(P=0.006)、德昂和普米(P=0.019)群体之间有统计学意义，而普米和德昂群体之间无统计学意义(P=0.195)。χ2检验比较DXS8378位点在三个群体男性的等位基因频率分布，结果提示德昂和傈僳(P=0.008)、德昂和普米(P=0.009)群体之间有统计学意义，而普米和德昂(P=0.168)群体之间无统计学意义。
　　
　　综上表明，通过重组质粒所获得的STR等位基因分型标准物，谱带清晰均一，虽然对试剂要求较高、制作工序及时间较多，但具有花费少、产量高及稳定性强的优点，既便于保存和繁殖，又便于远距离运输等其他方法无法比拟的优点，不同实验室可以使用相同的分型标准物，在我国的法科学领域中有较高的应用价值。本研究首次获得了X染色体DXS8378位点的等位基因分型标准物和在傈僳、普米、德昂族中的完整基因频率数据，其在其他人群中的情况，尚需进一步的研究。

参考文献

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