作者：黄国栋，黄媛华，黄道富，肖美珍，唐丽君，赵俊 黄国栋
【摘要】 目的 观察健胃愈疡颗粒(JWYY)对幽门螺杆菌相关性胃炎胃黏膜乳癌相关肽(PS2)和血小板活化因子(platelet activating factor， PAF)表达的变化，并分析其可能的作用机制。方法 80例幽门螺杆菌感染慢性胃炎患者随机分为2组，治疗组42例给予健胃愈疡颗粒治疗，对照组38例给予西药三联药物治疗。应用胃镜下活检胃黏膜组织快速尿素酶和Warthin-Starry染色法检测幽门螺杆菌，应用Western blot检测PS2、PAF表达变化。应用末端转移酶介导的dUTP切口末段标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。第4周复查胃镜。结果 治疗组凋亡指数明显比对照组减少(P&<0.05)，治疗组总有效率高于对照组(P&<0.05)。Western blot检测显示：JWYY颗粒可上调PS2并下调PAF的表达，而对照组对胃黏膜PS2和PAF的表达影响不大。结论 健胃愈疡颗粒治疗幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎可能与杀灭Hp、上调PS2和下调PAF的表达来抑制细胞凋亡有关。
【关键词】 幽门螺杆菌；胃炎；细胞凋亡；中医；血小板活
ABSTRACT: Objective To observe the expressions of PS2 and platelet activating factor (PAF) affected by Jianwei Yuyang (JWYY) Granule onhelicobacterpylori-associated gastritis and study the possible mechanism. Methods A total of 80 cases of helicobacterpylori-associated gastritis were randomly pided into two groups. The JWYY group consisted of 42 cases who were treated with JWYY granule and the control group had 38 cases who were given three combined western medicines. Urease test and Warthin-Starry method were used to detect H.pylor on biopsy specimens of gastric mucus， and Western blot method was used to observe the expressions of PS2 and platelet activating factor (PAF) affected by Jianwei Yuyang. TUNEL technique mediated by termina enzyme was used to detect the apoptotic body. All the cases who had taken JWYY granule were rechecked with gastroscope at the 6th week. Results The difference in apoptotic index between JWYY group and control group differed significantly， with the total efficacy of JWYY higher than that in control group (P&<0.05). The Western blot method showed that JWYY Granule could reduce the gastic mucosa’s expression of PAF， elevate the expression of PS2， but in the control group PS2 and PAF were little affected. Conclusion JWYY can kill H.pylori， reduce the gastic mucosa’s expression of PAF， elevate the expression of PS2 to suppress apoptosis. This may be the possible mechanism of JWYY for curing PU.
KEY WORDS: H.pylori; gastritis; apoptosis; Traditional Chinese Medicine; platelet activating factor (PAF); PS2
幽门螺杆菌(helicobacter pylori， Hp)与慢性胃炎的发生和发展密切相关，但其致病机制仍未完全清楚。大量报道认为，Hp能诱导细胞凋亡，导致胃黏膜的完整性破坏，从而产生或加重炎症或溃疡损伤［1］。三联药物丽珠得乐加阿莫西林和替硝唑治疗，由于其价廉质优， 是目前各级医院广泛运用的西药三联抗慢性胃炎药物。近年来我们用健胃愈疡(Jianwei Yuyang， JWYY)颗粒治疗幽门螺杆菌相关性胃炎取得了满意疗效，本课题通过胃镜下活检胃黏膜组织检测幽门螺杆菌，并同时检测血小板活化因子(platelet activating factor， PAF)、乳癌相关肽(PS2)的表达和胃黏膜上皮细胞的凋亡，并与西药三联对照，从而探讨健胃愈疡颗粒抗胃炎的作用机制。
1 材料与方法
1.1 一般资料
选择2005年5月-2006年7月因上消化道症状就诊，并在湖南省人民医院和湖南中医药大学附属衡阳医院行胃镜检查确诊为慢性胃炎的内科住院患者及门诊患者。所有患者均在接受胃镜检查前1月内未服用糖皮质激素、非甾体抗炎药及抗生素，并除外合并严重心、脑、肾等严重疾病患者。共有80例病例入选，纳入标准参照2000年井冈山《全国慢性胃炎研讨会议共识》相关标准［2］。
按随机抽签法进行分组。治疗组42例，其中男26例，女16例，年龄21-64岁，平均年龄(41.34±12.66)岁；其中胃黏膜炎症轻度者15例，中度17例，重度10例。对照组38例，其中男21例，女17例，年龄20-61岁，平均年龄(40.71±11.85)岁；其中胃黏膜炎症轻度者16例，中度16例，重度6例。上述一般临床资料经统计学处理，组间各项参数均衡性良好，具有较好的可比性(P&>0.05)。
1.2 药品及试剂
健胃愈疡颗粒剂(主要由柴胡、党参、白芍、延胡索、白芨、青黛、珍珠层粉、甘草组成，中南大学湘雅医院药房提供)；阿莫西林(广州珠海联邦制药)；丽珠得乐(丽珠集团制药厂生产)；替硝唑(湖南益阳制药厂生产)；原位细胞凋亡TUNEL检测试剂盒(武汉博士德公司)。PS2，PAF抗体(美国Santa Cruz公司)，Western blot及其相关试剂(晶美有限公司)。
1.3 标本来源及Hp阳性的诊断方法
胃镜检查时，每例患者取4块胃黏膜标本(即胃窦大弯侧，小弯侧和前后壁)，其中选胃窦部标本用于快速尿素酶试验和Wanthin-starry染色，两种检查均阳性判断为Hp阳性，其中一项阳性者不包括在本研究内。其余3块胃黏膜标本分别检测PAF、PS2的表达和细胞凋亡。
1.4 实验分组
治疗组给予健胃愈疡颗粒剂口服，3 g/包，9 g/次，3次/d，连服4周为一个疗程。对照组给予三联药物阿莫西林0.5 g/次，每日2次，早晚口服；丽珠得乐1包/次，每日2次；替硝唑0.5 g/次，每日2次。用药4周后复查。两组均于第4周复查胃镜，活检取材部位与第一次胃镜检查相同。
1.5 胃黏膜细胞的凋亡检测
TUNEL染色步骤：将胃黏膜标本石蜡包埋、切片后经脱蜡，20 mg/L蛋白酶消化液在室温下作用20 min；30 mL/L双氧水室温下孵育10 min阻断内源性过氧化物酶；滴加TUNEL反应液，37 ℃ 60 min；DAB显色，苏木素复染。光镜下观察：胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞，每张切片至少观察5个以上高倍视野，计算100个上皮细胞内的阳性细胞数，即为凋亡指数(AI)。Hp感染的诊断、组织学、细胞凋亡的观察采用双盲法。
1.6 Western blot法检测PAF、PS2的表达
参照《分子克隆指南》［3］第二版进行。抗体工作浓度分别是PAF(1∶100)，PS2 (1∶100)。
1.7 疗效评定标准
根据卫生部《中药新药临床研究指导原则》［2］中的有关标准拟定。治愈：Hp阴转，临床症状消失，胃镜和病理检查黏膜恢复正常；显效：Hp阴转，临床症状明显减轻，病变黏膜基本恢复正常；好转：Hp阴转或强阳性转为弱阳性，临床症状减轻，病变黏膜范围缩小2/3，炎症程度减轻。以上均为治疗有效。无效：Hp、临床症状及病变黏膜无改善。
1.8 统计学方法
采用SPSS10.0软件包对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，治疗前后比较采用配对t检验，组间比较经方差齐性分析后采用成组设计的t检验，治愈率比较采用χ2检验，P&<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床总有效率的比较
健胃愈疡颗粒组(治疗组)总有效率优于对照组(西药三联组)，两组差异有统计学意义(P&<0.05，表1)。表1 两组总有效率的比较（略）
2.2 治疗前、后胃黏膜上皮凋亡指数的变化
两组患者治疗后胃黏膜凋亡指数均较治疗前明显减少(P&<0.05)，两组患者治疗后治疗组凋亡指数明显比对照组减少(P&<0.05)，组间比较有显著性差异(P&<0.05，表2、图1)。表2 治疗前、后凋亡指数的变化（略）
2.3 两组治疗前、后Hp根除率的比较
治疗组42例Hp根除率为76.1%(32/42)，对照组Hp根除率为65.8%(25/38)，两组比较差异无统计学意义(P&>0.05)。
2.4 Western blot检测各组治疗前、后PS2、PAF的表达
结果 JWYY颗粒可提高PS2表达，下调PAF的表达，与对照组有显著性差异(P&<0.01)，较治疗前也有显著性差异(P&<0.01，表3、图2)。表3 各组患者治疗前、后PS2、PAF吸光度值检测结果的比较（略）
2.5 PS2、PAF与胃黏膜上皮凋亡指数的相关性分析
慢性胃炎患者胃黏膜上皮凋亡指数与PS2蛋白表达呈负相关关系(r=-0.841， P&<0.01)，和PAF蛋白表达呈正相关关系(r=0.902， P&<0.01)。
3 讨论
现代医学对慢性胃炎的疗效显著，但容易复发［1］。因此，揭示其发病及复发的机制并寻找有效药物仍是临床亟待解决的难题之一。细胞凋亡是基因调控下的程序性细胞死亡。在正常情况下，为清除衰老、异常细胞及控制细胞数量和体积，有部分细胞在机体的调控下发生凋亡以维持机体的稳态，当组织细胞发生凋亡异常时则可导致疾病发生［5］。
中医药在长期的临床实践中，对慢性胃炎的治疗也发挥了重要的作用，并取得了良好的临床疗效。健胃愈疡颗粒是结合现代药理学的最新研究成果和祖国医学的传统理论研制出来的，本研究表明，健胃愈疡颗粒使Hp根除率达到76.1%，并能显著减轻慢性胃炎胃黏膜的损害，两组患者治疗后胃黏膜凋亡细胞数目均较治疗前明显减少(P&<0.05)，且健胃愈疡颗粒组更明显，有显著性差异(P&<0.05)。这可能与它从整体调理出发，着眼于增强人体自身的正气，采用复方多环节、多途径、多靶点综合治疗实现对局部病理改变的修复，最大限度地调动机体抗病祛邪的能力有关。
PS2是一类对胃黏膜有保护作用的因子。大量证据表明，PS2在维持胃肠道黏膜的完整性及在加速损伤黏膜修复的过程中起重要作用［6］。研究表明：PS2有“运动因子”的作用，在溃疡修复时促进细胞迁移到病灶区，有助于维持黏膜的完整性［6-7］。PAF是一种内源性磷脂介质，它可与内毒素引起胃肠黏膜损伤［7-11］。本研究表明，JWYY颗粒可上调PS2和下调PAF的表达，而对照组对胃黏膜PS2和PAF的表达影响不大。经相关分析，慢性胃炎患者胃黏膜上皮凋亡指数与PAF、PS2之间均有直线相关关系。由此我们推测，JWYY颗粒发挥抗慢性胃炎的机制之一可能与其杀灭Hp、上调PS2和下调PAF的表达来抑制细胞凋亡有关。
参考文献
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