大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响

【摘要】 目的 探讨提高大鼠胰岛细胞产量和纯度的最佳分离纯化方法。方法 40只大鼠分为4组，每组10只。A组：Hanks液灌注+胶原酶V消化+Ficoll400梯度纯化；B组：组织剪碎研磨+筛网过滤；C组：胶原酶V灌注+Ficoll400梯度纯化；D组：胶原酶V灌注+筛网过滤。对用四种不同方法分离纯化的结果进行比较。结果 完全随机设计的方差分析显示，A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P&<0.05)；组间多重比较显示，A组收获量均高于B、D组(P&<0.05)，与C组比较差异无统计学意义(P&>0.05)；A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P&>0.05)。结论 用胶原酶V或Hanks液灌注，Ficoll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高，而且价格低廉，是一种较理想的胰岛细胞分离纯化方法。

【关键词】 胰岛细胞 分离 纯化 大鼠

　　ABSTRACT: Objective To explore the best method of isolating and purifying rat islet cells to improve the harvest and purity of rat islet cells. Methods Forty rats were pided into four groups， with ten rats per group. Group A: Rat pancreases were perfused with Hanks and digested by collagens V， islet cells were isolated and purified by gradient Ficoll400. Group B: Pancreases were cut and ground， then filtered with grid. Group C: Rat Pancreases were perfused with collagens V， islet cells were isolated and purified by gradient Ficoll400. Group D: Rat pancreases were perfused with collagens V， but filtered by grid. The harvest and purity of islet cells from four groups were compared and analysed. Results The differences in the harvest and purity of islet cells isolated and purified by the four methods (A， B， C and D groups) were significant by completely random variance analysis. Interclass multiple comparison manifested that the harvest in A group was higher than that in Group B and D， but not obviously different from that in Group C. The purity in A group was not significantly different from that in other groups. Conclusion The harvest and purity of islet cells isolated through Hanks perfusion and/or collagenase V digestion were higher than those of other methods. The cost of this method is lower， so it suggests that it is a better method for islet cell isolation.

　　KEY WORDS: islet cell; isolation; purification; rat

　　1型糖尿病主要因为胰岛细胞迅速被破坏，机体胰岛素分泌不足所致。患者必须长期依赖外源性胰岛素治疗，同时常伴有各种并发症。胰岛移植作为治疗1型糖尿病的方法之一，具有简捷、安全及有效等优点，其临床应用前景可观。然而，胰岛移植手术的效果并不是很理想，一个重要的原因就是可供移植的有功能的胰岛细胞数量不足及胰腺来源困难[13]。近几年来，尽管胰岛分离技术在传统的胆管胶原酶方法的基础上不断改进[4]，但所获得胰岛细胞的数量、活性和纯度仍有较大差异。随着胰岛移植技术的开展，对胰岛分离技术的要求越来越高。本研究拟用不同的方法对大鼠胰岛细胞进行分离和纯化，以寻求一种简便、快捷、廉价、高效的胰岛分离和纯化的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和主要试剂 40只SD大鼠均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。小牛血清购自杭州四季青生物制品公司；Ficoll400购自Phamacia公司；胶原酶V、双硫腙DTZ购自Sigma公司。

　　1.2 动物分组及胰岛细胞的分离和纯化方法 将40只SD大鼠随机分为A、B、C、D组，每组10只。0.27g/L盐酸氯胺酮(100mg/kg)腹腔内注射麻醉，酒精浸浴消毒，取腹壁正中切口打开腹腔，显露胰腺和胆总管[5]。A组：结扎胆总管进入十二指肠处，用4号半静脉穿刺针从胆总管注入Hanks液10mL，当胰腺膨胀时迅速摘取胰腺，在解剖显微镜下仔细清除脂肪组织、血管和淋巴结，Hanks液漂洗后用眼科剪剪成1-2mm3小块；把1g/L胶原酶(V型)加入剪碎的胰腺组织中，于7℃恒温水浴箱中边振荡边消化20-25min，直至成小颗粒状时加入4℃ Hanks(含10mmol/L Hepes的)洗液+10mL小牛血清，用80目不锈钢丝网过滤，将滤液离心(4℃，3000r/min，4min)，除去上清液，再以4℃ Hanks液洗涤两次；而尚未消化的组织再转移至0.5g/L胶原酶V中继续消化20-25min，直到组织呈沙粒状，再终止消化并离心。取15mL刻度离心管，将上述分离的胰岛沉淀物加入3mL的250g/L Ficoll400，充分混匀，随后不连续地缓慢依次加入230g/L(3mL)、200g/L(2mL)、110g/L(2mL)的Ficoll400，2000r/min离心10min，吸取110-200g/L及200-230g/L界面上的细胞，Hanks洗液洗涤3遍。B组：胰腺剪取后清除脂肪组织，置于80目筛网直接研磨，4℃ Hanks液冲洗筛网滤液经100目筛网过滤，滤过大的血管和淋巴结等成分，滤过后再经过400目筛网过筛，收集400目筛网上的细胞。C组：从胆总管插管注入0.5g/L胶原酶V 2-3mL，胰腺完全肿胀时迅速剪下胰腺。37℃恒温水浴箱中边振荡边消化20-25min，加入4℃ Hanks(含10mmol/L Hepes的)洗液+10mL小牛血清，将沉淀物加入3mL的250g/L Ficoll400，依次加入230g/L(3mL)，200g/L(2mL)，110g/L(2mL)的Ficoll400，2000r/min离心10min，吸取110-200g/L及200-230g/L界面上的细胞，Hanks洗液洗涤3遍，收集胰岛细胞。D组：不同于C组的是，不用Ficoll密度梯度离心收集胰岛细胞，只用400目筛网过滤，加入4℃ Hanks(含10mmol/L Hepes的)洗液稀释，收集筛网上的胰岛细胞并制成悬浊液，然后将悬浊液转移到10mL冰浴离心管内，低速离心4min。弃沉淀，上清重悬后再高速离心5min，收集沉淀。

　　1.3 胰岛的收获量和纯度的测定 双硫腙(Diphenylthiocarbazne， DTZ)配制方法：将100mg DTZ溶于10mL二甲亚砜(DMSO)溶液中，过滤分装，贮存在-20℃。取0.1mL细胞悬浊液，加入Hanks液0.4mL，DTZ工作液0.5mL，充分混匀，37℃孵育10min，注入血球记数板的记数池中，记数各方格中的阳性细胞数。显微镜下对阳性细胞团进行计数，每份样取3次，求其均数，再将均数转换成整份液体内的胰岛细胞数。通过镜检胰岛悬液中胰岛数量与外分泌组织量之比来估计纯度。每份样本取0.1mL液体涂片后再倒置显微镜下记数，每份样本取5个低倍视野，求其平均值。故胰岛细胞的纯度=(DTZ阳性细胞数/所有细胞数)×100%。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS10.0软件，对4组进行完全随机设计的方差分析(ANOVA)及多样本均数间的两两比较(LSD)，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 胰岛形态学观察 分离后胰岛呈圆形或椭圆形，大小不等，形态完整，呈淡黄色，表面包被有包膜；DTZ染色后，胰岛细胞呈猩红色，外分泌组织不着色。纯化后，外分泌组织明显减少(图1)。

　　图1 分离后胰岛细胞的DTZ染色（略）

　　Fig.1 DTZ dyeing of isolated islet cells (×400)

　　2.2 胰岛细胞收获量和纯度 完全随机设计的方差分析显示，A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P&<0.05)；组间多重比较显示，A组收获量均高于B、D组(P&<0.05)，与C组比较差异无统计学意义(P&>0.05)；A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P&>0.05，表1)。

　　表1 分离和纯化后单个胰岛细胞的收获量及胰岛细胞纯度（略）

　　Table 1 Extraction quantity and purity of the islet cells after separation and purification

　　A: Hanks+collagens V+Ficoll400; B: cut+filtere; C: collagens V+Ficoll400; D: collagens V+filtere. △P&<0.05 vs. A group

　　3 讨论
　　
　　胰岛移植的最大障碍是胰岛细胞的来源不足，分离出高活性和高数量的胰岛细胞是成人胰岛移植成功的关键[67]。由于胰岛分离纯化过程操作复杂，方法不一，人为影响因素较多，导致不同的研究中心分离结果相差较大[8]。尽管有研究表明胰腺导管上皮细胞和胚胎干细胞在一定的条件下可以分化为分泌胰岛素的胰岛细胞[9]，但从胰腺直接分离的胰岛细胞仍然是胰岛移植的主要来源，而胰岛移植成功的首要条件是获取足够有活性的胰岛。因此，研究胰岛细胞的分离和纯化的方法具有非常大的意义。
　　
　　胰腺导管灌注消化法是较常用的一种方法。但是，大鼠的胆总管相对细小，在灌注时操作难度较大。A组采用Hanks液经胰管灌注，通过机械扩张破坏外分泌腺泡，灌注Hanks液可以防止胰腺灌注后酶溶液的外漏，有利于摘取完整的胰腺，是一种价廉有效的分离方法。B组机械研磨法操作方法简单，但是胰岛细胞获取率低，胰岛细胞的损伤大，虽然在胰岛纯度方面与A组无显著性差异，但收获量低于A组，因此直接剪取胰腺剪碎消化法不可取。C组用胶原酶直接灌注消化，在机械扩张破坏外分泌腺泡的同时，也对外分泌腺起到初步消化的作用，明显提高了产量，节省时间，胶原酶用量少，收获量纯度与A组没有显著性差异，但是价格较昂贵，临床推广有一定的难度，可能原因与胶原酶灌注所需要的时间、温度和掌握经验有关。在实验中为了得到大量的胰岛细胞，在各个方法的分离消化过程中，我们严格控制温度及pH值，以达到合适的消化浓度。由于胶原酶浓度没有统一的标准，到底多少为满意的胶原酶浓度，现在没有统一的标准。我们采用1.0g/L浓度进行消化，下一步还将对胶原酶的浓度进行进一步的研究，找到合适的胶原酶浓度进行消化。据张桦等[10]报道，必须严格控制消化时间、温度及pH值，消化过度的胰岛容易破碎，增加分离胰腺的困难；而消化不足易形成大量片段胶原纤维，捕获游离的胰岛，减少胰岛的收获量。张雷等[11]的经验是，为减少胶状物的形成，以获取更多的胰岛，严格控制消化温度和时间，维持pH值，消化液与胰腺的体积比大于5∶1，终止消化时Hanks量必须足够。
　　
　　另外，本文结果表明，用滤网和Ficoll400梯度纯化比较没有统计学差异，可能原因与在获取与纯化的过程中胰岛细胞因为缺氧直接坏死和凋亡的，不可避免地造成部分胰岛丧失有关，也可能与操作技术、实验室的条件等有很大的关系。
　　
　　总之，我们认为用胶原酶V或Hanks液灌注，Ficoll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高，而且价格低廉，是一种较理想的胰岛细胞分离方法。

参考文献

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