作者：申萍香，吴璇，黄江，胡旭初，余新炳，包怀恩，廖兴江
【摘要】 目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-EF-1构建成功。重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别，表明其具有免疫反应性。结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】 亚洲牛带绦虫；延伸因子-1；基因克隆；原核表达
ABSTRACT: Objective To clone and express the novel gene named elongation factor 1 (EF-1) of Taenia saginata asiatica in order to analyze the immunogenicity of the recombinant protein. Methods By screening the full length cDNA plasmid library， the coding region of EF-1 was amplified with PCR， and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. The recombinant protein was detected by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography， and its immunogenicity was analyzed by Western blotting. Results PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid was successfully constructed. Western blot analysis of EF-1 recombinant protein testified that the recombinant protein could be recognized by immunizing the serum of swine and patient， therefore indicating its immunogenicity. Conclusion A novel gene coding EF-1 of Taenia saginata asiatica was cloned and expressed successfully. The purified protein of EF-1 will be of importance for further research on the biological function of the gene.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; elongation factor 1(EF-1); molecular cloning; prokaryotic expression
亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)是近30年来发现的一种成虫形态与牛带绦虫相似，而囊尾蚴却与猪囊尾蚴相似并以猪作为中间宿主的人体带绦虫。2006年我们在前期研究的基础上进一步系统地开展对亚洲牛带绦虫在分类地位、分子诊断和疫苗等方面的研究［1-4］，为制定预防人体带绦虫病策略提供依据。本研究从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出一个延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)的同源基因，构建了pET-28a(+)-EF-1原核表达载体，并对其原核表达产物进行了初步的免疫学研究，为进一步研究其生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清来源
感染亚洲牛带绦虫猪血清由贵阳医学院寄生虫学教研室提供，患者血清采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，健康人血清由中山大学热带病重点实验室提供。
1.1.2 文库、质粒、菌株
虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene 分析与上海联合基因有限公司合作完成。原核表达质粒pET-28a(+)和大肠杆菌BL-21/DE3由中山医学院病原生物学实验室保存。
1.1.3 主要试剂和工具酶
Ex Taq酶(含dNTP)、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶及DNA标准(DL2000)均购自大连宝生物工程公司；异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)购自美国Promega公司；Ni-IDA Agarose(cat No：69670)购自美国Novagen公司；蛋白分子量标准购自立陶宛MBI公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京赛百盛基因公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、DAB(3，3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TMB显色试剂盒购自美国BD公司；SDS、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、尿素等试剂均购自上海申友生物科技公司。
1.1.4 引物合成和DNA测序
基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 EF-1基因的识别
将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，获得编码亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因文库质粒编号为T.a HC23-E9，GenBank登录号为EF420501的同源基因；并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY， http://ca.expasy.org/)预测其理化特性。
1.2.2 EF-1基因的扩增 根据已获得的EF-1编码序列，利用DNAClub和PCRdesign设计引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，带EcoRⅠ酶切位点；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，带XhoⅠ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中EF-1基因的克隆质粒为模板，94 ℃预变性5 min后，热循环参数为94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 重组原核表达质粒［pET-28a(+)-EF-1］的构建及鉴定
将PCR产物和原核表达质粒pET-28a(+)经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4 重组蛋白的表达
将确定能表达重组蛋白的单菌落接种于5 mL LB培养基中，过夜培养后1∶100转接到1 000 mL培养基中，培养至A600约为0.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，28 ℃、250 r/min进行诱导。诱导4 h后离心收菌，用SDS-PAGE检测蛋白质的表达。
1.2.5 菌体的裂解、重组蛋白可溶性判断及待纯化融合蛋白上清的制备
取单菌落接种于1 000 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃震荡培养至A600为0.6时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，28 ℃震荡培养4 h，4 ℃离心(6 000 g×10 min)，收集菌液，按文献［5］的方法，每克菌(湿重)加入3 mL裂解缓冲液，重悬细菌沉淀，裂解液冰上超声破碎(160 W，超声1 s，停2 s，超声5 min)，4 ℃ 13 000r/min离心20 min，收集上清和沉淀，分别取上清10 μL加入4×SDS上样缓冲液和沉淀微量加1×SDS上样缓冲液，煮沸5-10 min后行150 g/L SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。
1.2.6 尿素变性纯化重组蛋白
在得到的包涵体(超声后沉淀)中加入A液10 mL重悬，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，重复2次，再用B液洗涤1次，4 ℃ 6 000 r/min离心15 min。将洗涤后的包涵体沉淀加入8 mol/L尿素(溶于基础液)18 mL放置1 h左右，沉淀完全溶解，溶液清亮透明。采用透析法，逐步降低尿素浓度(8-6-5-4-3-2-1 mol/L PBS溶液)。
1.2.7 Western blotting检测重组蛋白的免疫反应性
将纯化的蛋白进行120 g/L SDS-PAGE电泳，使用电转移仪于100 V冰浴转印1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上，将含预染蛋白Marker条带剪下，PVDF膜转入感染亚洲牛带绦虫猪和患者血清中(1∶100稀释)，室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪和抗人IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色至出现目的条带，超纯水终止反应［6］。
2 结 果
2.1 生物信息学分析
该基因与细粒棘球绦虫EF-1基因(登录号为AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%；全长988 bp，编码区67-868，编码269个氨基酸。理论分子质量和等电点分别是28 067.8 u和4.88［7］。
2.2 原核重组质粒的鉴定
将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500-1 000 bp之间有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.3 蛋白表达纯化结果
将构建好的重组质粒转化到E.Coli BL-21/DE3中表达，SDS-PAGE电泳分析结果如图2中第4、5泳道所示，大约在34 ku左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。通过破包涵体，将蛋白进行纯化，结果如图2中第6、7泳道所示，其位置与目的蛋白相符，证明目的蛋白纯化成功。
2.4 Western blotting鉴定
感染亚洲牛带绦虫的猪血清以及感染亚洲牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的Western blotting均显示出清晰的条带(图3)。
3 讨论
研究表明，EF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、翻译过程中起重要作用［8］。EF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成，其中EF-1α属于G蛋白家族，它和氨酰tRNA、GTP一起组成复合体，通过正确地识别mRNA上的密码子和tRNA上的反密码子，负责转运氨酰tRNA 到80S核糖体，并具有低水平GTP酶的活性。EF-1β具有鸟苷酸交换活性，在EF-1α从核糖体离开并且构象由GDP形式变成GTP准备与新的AA-tRNA相互作用的过程中，需要EF-1β作为催化剂。EF-1γ常与EF-1β形成复合物，具有增加后者鸟苷酸交换的功能。至少在脊椎动物中，EF-1还有第四个亚基EF-1δ，尤其在其羧基端与EF-1β具有同源性，而在氨基端无同源性，表明它们可能具有不同的功能［9-10］。我们从亚洲牛带绦虫cDNA文库中识别出了一个EF-1的全长编码基因，其编码的氨基酸序列与GenBank中细粒棘球绦虫的EF-1基因 (登录号为AAF64192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%，推测其为亚洲牛带绦虫EF-1基因，并且含有完整的开放阅读框，是一个全长cDNA序列。
通过生物信息学分析，该蛋白的理论分子质量为28 067.8 u，而质粒pET-28a(+)的载体标签序列的分子质量为6 ku，所以重组蛋白的分子质量大约应为34 ku。图2的4泳道显示的重组蛋白条带与预期的大小是一致的，并且条带很浓，但从该图的5泳道看出上清没有表达，说明该蛋白是以包涵体的形式表达，通过尿素变性纯化重组蛋白，得到了条带很浓的纯化蛋白(图2第7泳道)。本研究为包涵体蛋白的纯化积累了经验，同时还证实了重组蛋白在纯化后具有免疫反应性，获得了具有免疫活性的重组蛋白，为进一步研究其生物学功能以及在诊断尤其是疫苗研究方面的作用奠定了基础。
参考文献
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