【摘要】 目的 探讨电针对慢性癫痫大鼠海马新生神经元生长抑素(SS)表达的影响。方法 应用免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜观察了电针慢性癫痫大鼠督脉穴位“大椎”与“百会”后海马新生神经元生长抑素的表达情况。结果 海马新生神经元有SS的表达，且电针后的癫痫大鼠表达比未电针的癫痫大鼠减少，差异有统计学意义(P&<0.05)。结论 电针可抑制海马新生神经元SS的表达，而SS有致痫作用。由此推测电针的抑痫机制可能是通过海马新生神经元SS的表达而实现的。
【关键词】 癫痫；海马；新生神经元；电针；5-溴脱氧尿核苷；生长抑素
ABSTRACT: Objective To explore influence of electroacupuncture on somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Methods The double-label immunofluorescence with confocal microscope was used to observe somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats after electroacupuncture stimulation of Dazhui (GV14)’ and Baihui (GV20)’ in DuMai. Results Somatostatin expression of newborn neurons was found in the hippocampus. Moreover， in somatostatin expression of newborn neurons， epileptic rats with electroacupuncture had less than epileptic rats in the hippocampus.The former had an obviously significant difference compared with the latter (P&<0.05). Conclusion Somatostatin is involved in proconvulsion. Electroacupuncture inhibits somatostatin expression of newborn neurons in the hippocampus of chronic epilepsy rats. Electroacupuncture inhibits epileptogenesis by decreasing somatostatin colocalized with newborn neurons in hippocampus.
KEY WORDS: epilepsy; hippocampus; newborn neuron; electroacupuncture (EA); BrdU (bromodeoxyuridine); somatostatin
早在20世纪中期就有人报道，成年哺乳动物海马区能生成一定数量的新神经元。近年来随着神经干细胞研究的逐步深入以及5-溴尿嘧啶核苷(5-bromo-deoxyuridine， BrdU)这一增殖细胞标记物的广泛应用，研究者发现成年海马区不但确实存在可分化为神经元的增殖细胞，而且其数目远多于人们的想象。该部位神经干细胞微环境的改变将能阻抑或增强海马齿状回的神经发生。既往的研究已证实反复的痫性发作可引起海马新生神经元增加［1-5］，但这些新生神经元究竟有无功能及发挥哪种功能至今仍不清楚。
许多研究表明，在各种癫痫动物模型的脑组织和癫痫患者病灶脑组织中生长抑素(somatostatin， SS)的含量有异常变化，提示SS可能参与了癫痫的发作过程。为此，本实验拟采用匹罗卡品诱导的癫痫持续状态(status epilepticus， SE)后慢性癫痫模型，一方面观察了海马新生神经元是否有SS的表达，另一方面观察了电针干预后对海马新生神经元SS表达的影响，并探讨了电针对海马新生神经元影响的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠22只，体重180-200 g，由第四军医大学实验动物中心提供。动物饲养于12-12 h(8:00-20:00)光暗环境，给予标准饲料及饮水。
1.2 主要试剂
盐酸匹罗卡品、小鼠抗BrdU抗体、兔抗SS抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体、Cy3标记的驴抗兔抗体均购自Sigma公司；标记有丝分裂活动细胞的BrdU粉剂购自Boehringer Mannheim公司；氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司。
1.3 主要仪器
恒冷冰冻切片机(美国)；激光共聚焦显微镜(Olympus FV300)；G6805型电针仪(上海医用电子仪器厂)。
1.4 方法
1.4.1 锂-匹罗卡品癫痫模型的制作
造模大鼠先腹腔注射新鲜配制的氯化锂，剂量为3 mmol/kg，20 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品，剂量为30 mg/kg。对照组大鼠注射等量的生理盐水。出现SE后60 min腹腔注射地西泮注射液(4 mg/kg)以终止SE，降低死亡率。
1.4.2 电针刺激参数及电针方法
电针处理动物均在匹罗卡品或生理盐水处理后3 d时开始予以电针刺激，并连续刺激28 d。电针刺激参数：电针督脉穴位“大椎”与“百会”，取穴参考《兽医针刺学》［6］，采用疏密波。密波：6.25 Hz，1.8-4.9 mA，时间2.08 s；疏波：3.85 Hz，1.4-2.0 mA，时间1.28 s。持续20 min。为了防止动物挣扎，在针刺前稍给乙醚麻醉，然后将动物固定于针刺操作台上，选用1寸毫针进行针刺，“百会”穴平刺，“大椎”穴斜向上刺，约0.7寸。
1.4.3 实验动物分组
癫痫组8只，均先腹腔注射新鲜配制的氯化锂(3 mmol/kg)，20 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品(30 mg/kg)，未行电针刺激；对照组4只，均注射等量的生理盐水，未行电针刺激；癫痫+电针组共6只，均先腹腔注射新鲜配制的氯化锂(3 mmol/kg)，20 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品(30 mg/kg)，并行电针刺激；对照+电针组共4只，均注射等量的生理盐水，并行电针刺激。
1.4.4 BrdU给药方法及标本制备［7］
实验大鼠在匹罗卡品或生理盐水处理后3 d时分别腹腔注射4次BrdU(50 mg/kg，溶解于0.007 mol/L NaOH/生理盐水)，间隔12 h注射1次。所有实验大鼠均在最后一次注射BrdU后的28 d以戊巴比妥(50 mg/kg)深麻醉，先经升主动脉灌注生理盐水100 mL，40 g/L多聚甲醛液(pH 7.4)快速灌注200 mL后，再慢速灌注300 mL。取脑后，将脑组织入40 g/L多聚甲醛后固定过夜，再入200 g/L蔗糖4℃冰箱沉底。选择背侧海马部位应用恒冷冰冻切片机冠状位连续切片，脑片漂片厚30 μm，行免疫荧光标记者收集于0.01 mol/L KPBS中，余置于60%(体积分数)甘油冻存液中-20 ℃保存备用。
1.4.5 免疫荧光双标记法标记BrdU与SS
取切片入50%(体积分数)甲酰胺/2×SSC中65 ℃ 2 h，2×SSC漂洗后，入2 mol/L HCl中37 ℃ 30 min，0.01 mol/L(pH 8.5)硼酸液中和10 min，浸入含0.3%(体积分数)Triton X-100的0.01 mol/L KPBS 30 min后，采用鸡尾酒法进行双标记染色。首先入小鼠抗BrdU抗体(1∶200)和兔抗SS抗体(1∶500)，4 ℃孵育48 h后，0.01 mol/L KPBS漂洗，然后入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200)和Cy3标记的驴抗兔IgG(1∶300)，避光孵育2 h，漂洗后常规贴片、缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。
1.4.6 细胞计数与统计学分析
每只大鼠取6张非连续的背侧海马一侧脑片进行观察，实验组及对照组大鼠根据解剖学定位标志取相近部位的脑片。为了定量观察，所取脑片之间至少间隔150 μm。200倍光镜下观察大鼠海马齿状回的BrdU阳性细胞数并计数BrdU阳性细胞中SS的阳性细胞数。细胞计数采取手工方法，由不知道实验设计的有经验的实验师进行。计数结果以均数±标准差表示。采用SPSS10.0统计软件进行最小显著差值(LSD)法t检验，P&<0.05时判定差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫双标记情况
激光共聚焦显微镜下发现，海马齿状回BrdU免疫阳性细胞多分布于颗粒细胞层，呈圆形或卵圆形结构；门区及皮质中也有少量的BrdU免疫阳性细胞。SS免疫阳性细胞形态各异，为多形态或双极神经元，分布均匀。齿状回颗粒细胞层BrdU免疫阳性细胞大多数表达有SS。
2.2 各组海马齿状回新生神经元SS表达的比较
海马新生神经元(BrdU免疫阳性细胞)有SS的表达，且电针后的癫痫大鼠其表达比未电针的癫痫大鼠减少，二者相比有统计学差异(P&<0.05)；癫痫组与对照组比较亦有统计学意义(P&<0.05)；对照组与对照+电针组大鼠海马齿状回SS的表达均无统计学意义(P&>0.05，表1、图1)。表1 各组海马齿状回新生神经元SS的表达情况（略）
3 讨论
癫痫作为神经科的一种常见病，其发病机制一直是国内外研究者关注的焦点，神经肽在其中起着不可忽视的作用。目前许多研究发现，在各种实验性癫痫动物模型和癫痫患者的脑组织中，SS的含量有异常变化，提示SS与癫痫发作密切相关。但SS在癫痫中的作用是致痫还是抑痫尚未完全明确。
既往的研究表明，正常大鼠中短暂的癫痫发作、点燃，甚至是单次发作均可导致新生神经元增加，增加的新生神经元是机体对癫痫发作的反应，而并非细胞损伤的结果。此种新生神经元具有何种功能目前尚不清楚。因此，本实验采用匹罗卡品诱导的SE后慢性癫痫模型，通过激光共聚焦观察了海马新生神经元SS的表达情况及电针对其表达的影响，从而明晰SS在癫痫中的作用。
细胞增殖周期包括G1、S、G2和M 4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种嘧啶类似物，其化学结构特点是胸腺嘧啶环与5位C原子连接的甲基被Br取代，当细胞处于DNA合成期而同时有BrdU存在时就会有BrdU掺入到新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU在胞核的DNA中存留将是永久的。抗BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组化可观察到BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU是反映细胞增殖的理想指标［8］。NeuN为成熟神经元标记物［9］，NeuN共标记结果显示90%以上新生细胞是神经元［10］，故本实验省去了BrdU与NeuN双标记步骤。
据中医经络理论，癫痫是由督脉经气阻滞，头中逆乱所致。历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。现代研究也证实，督脉位居身体的中轴线上，可以通过双侧神经司控的特性，促进脑功能的代偿和重组作用。大椎、百会为督脉之要穴，二者相配，共奏疏通气血、醒脑开窍、回阳救逆、平衡阴阳之效。根据上述理论，本实验选取督脉经百会、大椎二穴进行研究。
本实验通过免疫双标和激光共聚焦显微镜发现，海马齿状回颗粒细胞层BrdU免疫阳性细胞大多数表达有SS，且电针后的癫痫大鼠海马新生神经元SS的表达比未电针的癫痫大鼠减少，二者差异有统计学意义(P&<0.05)。以上发现提示：①SS有致痫作用；②新生神经元有SS表达；③电针可抑制新生神经元SS的表达。考虑表达SS的新生神经元轴突在海马内可能形成了一种“兴奋性环路”，而电针可抑制新生神经元的突触重组，由此推测电针的抑痫机制可能是通过减少新生神经元SS的表达而实现的。
本研究发现海马新生神经元可以表达SS，参与了致痫作用，提示新生神经元具有重要功能。而电针可以通过减少海马新生神经元SS的表达而实现抑痫机制。该发现不但为研究癫痫发作后大脑的可塑性变化提供了新思路，而且为内源性神经干细胞移植治疗神经系统变性疾病提供了理论依据。
参考文献
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