作者：褚薇薇，武步强，沙焕臣，王殿华
【摘要】 目的 探讨缺血后处理对大鼠肠缺血-再灌注损伤肠黏膜细胞线粒体的影响。方法 SD大鼠32只随机分为4组(n=8)：假手术(S)组、缺血-再灌注(I/R)组、缺血预处理(IPC)组、缺血后处理(I-post)组。应用透射电子显微镜、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、激光共聚焦扫描显微镜分别观测各组大鼠肠黏膜细胞线粒体的形态结构、呼吸功能以及线粒体跨膜电位的变化。结果 与I/R组相比，I-post组和IPC组大鼠肠黏膜细胞线粒体形态结构改变明显减轻，线粒体呼吸功能和线粒体跨膜电位明显升高(P&<0.05)；I-post组与IPC组相比，差异无统计学意义(P&>0.05)。结论 缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤的作用机制可能与改善肠黏膜细胞线粒体的形态结构和呼吸功能及提高线粒体跨膜电位有关。
【关键词】 缺血-再灌注；缺血后处理；缺血预处理；线粒体；肠黏膜
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of ischemic postconditioning (I-post) on intestinal mucosa mitochondrion after ischemia-reperfusion (I/R) injury in rat intestine. Methods By using rat model of intestine I/R injury， male Sprague-Dawley rats were pided into 4 groups: sham-operation group (S)， I/R group (I/R)， ischemic preconditioning group (IPC)， and I-post group. Intestinal mucosa mitochondrial ultrastructural changes were observed by using transmission electron microscope (TEM). Mucosal cellular mitochondrial respiration function was studied by measuring the mitochondrial dehydrogenase-dependent reduction of MTT to its formazan derivative， and intestinal mucosal mitochondrial membrane potential was detected by confocal laser scanning microscopy. Results Compared with that in I/R group， the injury of mitochondrion in I-post group and IPC group began to recover. The mitochondrial respiratory function and the mitochondrial membrane potential were significantly improved in I-post group and IPC group (P&<0.05). There were no significant differences between I-post group and IPC group (P&>0.05). Conclusion The mechanism of ischemic postconditioning against I/R injury of intestine in rats is partly related to maintaining the mitochondrial ultrastructural changes and respiratory function and improving mitochondrial membrane potential.
KEY WORDS: ischemia-reperfusion; ischemic postconditioning; ischemic preconditioning; mitochondrion; intestine
我们先前的研究表明，缺血后处理(ischemic postconditioning， I-post)具有抗大鼠肠缺血-再灌注(ischemia-reperfusion， I/R)损伤的作用，但其机制尚不清楚［1］。新近研究表明，线粒体在缺血后处理抗心肌缺血-再灌注损伤过程中起关键作用［2-3］，而且近年来关于线粒体在缺血-再灌注损伤导致细胞凋亡机制中的作用越来越受到重视［4-5］。因此，从线粒体角度研究细胞凋亡调控机制在缺血-再灌注损伤过程中的作用具有重要意义。
本研究从亚细胞水平探讨缺血后处理对缺血-再灌注损伤大鼠肠黏膜细胞线粒体形态和功能的作用，可为阐明缺血后处理抗缺血-再灌注大鼠肠黏膜细胞凋亡的发生机制提供科学的理论依据，为缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤提供新的作用靶点。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；线粒体跨膜电位检测试剂盒(JC-1)由碧云天生物技术研究所提供。激光共聚焦扫描系统(德国，型号MCR-1024ES)；透射电子显微镜(日本，型号JEM-011)。
1.2 实验动物
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，体重230-280 g，由昆明医学院实验动物中心提供，术前禁食12 h，不禁水。
1.2.1 动物模型的复制
动物腹腔注射200 g/L乌拉坦(1g/kg)麻醉后，仰卧固定于操作板上，消毒后取腹正中切口长约3 cm进腹，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉(superior mesenteric artery， SMA)，在其根部用无创伤血管夹夹闭阻断SMA血运45 min，造成肠缺血模型，然后松夹，再灌注1 h后经颈动脉放血处死。
1.2.2 动物分组及处理
动物随机分为4组(n=8)：①假手术(S)组：仅行开腹，分离SMA不夹闭；②缺血-再灌注(I/R)组：方法见模型复制；③缺血预处理(IPC)组：夹闭SMA 5 min和松夹5 min作为预处理，2个循环，余同I/R组；④缺血后处理(I-post)组：缺血45 min后即刻行3个循环的灌注30 s/阻断30 s，余同I/R组。
1.3 标本收集
于再灌注1 h时处死各组大鼠，迅速取距回盲部2 cm的小肠组织90 cm，分离大鼠肠黏膜细胞的方法
参考文献
［6］。另取1 cm小肠组织浸泡于3.5%(体积分数)戊二醛溶液(4 ℃保存)中待作透射电子显微镜观察。1.4 观察项目
①透射电子显微镜下观察肠黏膜细胞线粒体形态结构的改变；②MTT比色法检测大鼠肠黏膜细胞线粒体的呼吸功能；③激光共聚焦扫描显微镜检测各组大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位的变化。严格按照试剂盒说明书操作，并记录红、绿荧光值，计算红绿荧光的比值可以衡量线粒体跨膜电位的变化情况。
1.5 统计学处理
实验数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS12.0统计软件包进行统计分析和检验，组间比较采用方差分析，当P&<0.05时，进一步作均数的两两比较(q检验)。以P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肠黏膜细胞线粒体形态结构的变化 透射电子显微镜下可见，S组大鼠肠黏膜细胞微绒毛排列整齐，细胞连接结构正常，线粒体大小均一，椭圆形，内嵴清晰(图1A)；I/R组大鼠多数肠黏膜上皮细胞肿胀，细胞表面微绒毛数量明显减少且排列较乱， 微绒毛稀疏、变短、脱落，线粒体大小不一，有的线粒体数目增加，明显肿胀，空泡变性，严重者可见嵴减少或消失(图1B)；I-post组和IPC组大鼠多数肠黏膜上皮细胞肿胀程度减轻，大多数线粒体肿胀减轻或恢复正常状态(图1C、1D)。
2.2 大鼠肠黏膜细胞线粒体呼吸功能的变化
与S组相比，I/R组大鼠肠黏膜细胞线粒体呼吸功能明显下降(0.3 926±0.0 736 vs. 0.8 401±0.0 627， P&<0.05)；I-post组大鼠肠黏膜细胞线粒体呼吸功能明显高于I/R组(0.5 186±0.1 686 vs. 0.3 926±0.0 736， P&<0.05)，I-post组与IPC组相比，差异无统计学意义(0.5 586±0.1 212 vs. 0.5 186±0.1 686， P&>0.05)。
2.3 大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位的变化
与S组相比，I/R组大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位显著下降(P&<0.05)；I-post组则明显高于I/R组(P&<0.05)，与IPC组相比，差异无统计学意义(P&>0.05，表1)。表1 各组大鼠肠黏膜细胞线粒体膜电位的变化（略）
3 讨 论
研究表明，肠黏膜细胞凋亡增加与肠缺血-再灌注损伤关系密切。细胞凋亡主要通过两条途径，即死亡受体途径和线粒体途径。在缺血-再灌注损伤的过程中，上述两条途径都参与了细胞凋亡的发生［7］。研究发现，在检测到经典的细胞凋亡特征以前，线粒体膜的完整性及其功能就已经发生了重大变化，包括线粒体呼吸链电子传递中断，能量供应受阻，线粒体跨膜电位的下降甚至丧失和(或)蛋白质通过外膜的释放。因此，线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，尤其线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。新近提出线粒体在缺血后处理抗心肌缺血-再灌注损伤过程中起关键作用［2］。有关线粒体在缺血后处理抗肠缺血-再灌注损伤中的作用国内外未见报道。
本实验采用MTT比色方法检测细胞线粒体将MTT还原成甲臢的能力。MTT主要被电子传递过程中细胞色素氧化酶和泛醌还原，可反映电子传递的完整性，是广泛用作检测细胞活力的指标，反映线粒体的呼吸功能。本实验结果显示，大鼠发生缺血-再灌注1 h后，肠黏膜细胞线粒体呼吸功能明显下降，形态上表现为线粒体空泡化、嵴断裂或缺失。结果提示线粒体受损在肠缺血-再灌注早期损伤过程中起重要作用。
亲脂阳离子荧光染料JC-1低毒、可溶性强，加上较好的膜通透性，使之成为目前最理想的研究线粒体跨膜电位的探针。本研究还采用先进的激光共聚焦显微镜，用JC-1作为荧光探针检测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位的变化，结果发现肠缺血-再灌注损伤后肠黏膜细胞线粒体红色荧光减弱，绿色荧光增强，提示线粒体跨膜电位明显降低，说明再灌注损伤早期可导致线粒体膜通透性增加，膜稳定性下降。这与文献报道一致［8］。
目前，缺血预处理是减轻动物肠缺血-再灌注损伤的最有效方法，但临床上许多疾病何时发生缺血以及发生何种程度的缺血在大多数疾病中无法预料，这大大限制了缺血预处理在临床的应用。缺血后处理是一种应用于再灌注早期的新的机械性干预措施，具有可预知性和可控制性的特点，而且其在临床上应用简单、方便、可行，易为外科医生所接受。本研究结果显示，缺血后处理能够有效改善缺血-再灌注损伤后大鼠肠黏膜细胞线粒体的形态和呼吸功能，提高线粒体跨膜电位，提示缺血后处理抑制肠黏膜细胞凋亡可能改善线粒体结构和功能有关。这与缺血预处理的作用机制相似。
综上所述，线粒体在缺血后处理抗大鼠肠缺血-再灌注损伤作用机制中起重要作用，抑制细胞凋亡的线粒体途径可能有希望成为治疗缺血-再灌注损伤的有效作用靶点。
参考文献
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