作者：刘清君，胡敏棣，刘彩梅，巩婷
【摘要】 目的 观察超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾细胞白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)的诱生作用，探讨其对荷瘤小鼠免疫系统的调节机制。方法 采用超滤膜分离技术提取当归补血汤，用双抗体夹心ELISA法检测培养脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ的含量，用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达水平。结果 超滤膜提取当归补血汤各剂量组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-2和IFN-γ的含量均较模型组增高，大剂量组与模型组比较有显著性差异(P&<0.05)。各剂量组小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达水平均增高，中剂量组和大剂量组与模型组比较，均有显著性差异(P&<0.05)。结论 超滤膜提取当归补血汤能够促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌及其mRNA的表达，从而发挥免疫调节作用。
【关键词】 超滤膜；当归补血汤；白细胞介素-2；γ-干扰素
ABSTRACT: Objective To evaluate the effect of ultra-filtration extract from Danggui Buxue Decoction (DBD) on immune function of h32 bearing mouse and explore the mechanism through observing the effect of ultra-filtration extract from DBD on the secretion of the cytokines (IL-2， IFN-γ). Methods We used membrane separation technique to extract DBD. The content of IL-2 and IFN-γ in splenocyte culture supernatant was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)， and the mRNA expression of cytokines (IL-2， IFN-γ) in splenocytes was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR). Results The content of IL-2 and IFN-γ in splenocyte culture supernatant was increased in ultra-filtration extract from DBD groups， significantly in high-dose group (P&<0.05). The mRNA expression of IL-2 and IFN-γ was higher in DBD groups than that in negative control， markedly higher in medium-dose group and high-dose group (P&<0.05). Conclusion Ultra-filtration extract from DBD groups has the function of facilitating the secretion and gene transcription of cytokines (IL-2， IFN-γ) in h32 bearing mouse. It can improve the immune function of tumor-bearing mouse and inhibit the growth of the tumor.
KEY WORDS: ultra-filter; Danggui Buxue decoction; interleukin-2 (IL-2); interferon-γ (IFN-γ)
膜分离技术(membrane separation technique)是一项新兴的高效分离技术，已被国际公认为21世纪最具发展前途的重大高新生产技术［1］。超滤膜分离技术是膜分离技术的重要分支，其基本原理是在外界压力作用下，利用膜孔径选择性筛分功能，以达到分离、提纯和浓缩物质的作用［2］。由于它是一种简单的物理分离过程，操作中无相应化学变化，不添加任何化学药物，因此在中药产业中的应用具有独特的优势和较大的开发潜力。目前，日本等发达国家已将超滤膜分离技术应用于中药的提取过程，以达到降低生产成本，提高药品质量和稳定性的目的［3］。
超滤膜提取当归补血汤为经典方当归补血汤(黄芪∶当归=5∶1)的膜提取物，此方出自李东垣的《内外伤辨惑论》，是一首补气生血名方，其临床应用非常广泛，但研究所用制剂多为粗制水煎剂，且对免疫系统影响的机制研究也不够深入。作者采用超滤膜分离技术提取当归补血汤获得了分子质量相对稳定的膜提取物，并观察其对荷瘤小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ的诱生作用，以进一步探讨其免疫调节的机制。
1 材料与方法
1.1 动物与瘤株
健康BALB/c小鼠50只，雌雄各半，体重(20±2)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2004-0006-0000012。h32(肝癌)瘤株，由甘肃省医学科学研究院药理毒理研究中心提供。
1.2 药品与试剂
超滤膜提取当归补血汤，其制备依照文献［4］提供的方法进行，以生药煎煮→粗滤→浓缩→微滤→超滤→浓缩→包装、备用的流程制成每毫升含1g生药的超滤膜提取药液(分子质量&<10万)；刀豆蛋白A(ConA)为北京鼎国生物技术发展中心产品；淋巴细胞分离液为天津生物技术开发中心产品；RPMI1640为美国Gibco公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；小鼠IL-2、IFN-γ ELISA试剂盒为北京晶美生物工程有限公司产品；Trizol为美国Invitrogen公司产品；DEPC为博士德生物公司产品；RT-PCR扩增试剂盒及Marker为上海生物工程技术服务有限公司产品；IL-2、IFN-γ、β-actin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成(表1)。表1 IL-2、IFN-γ、β-actin 引物序列（略）
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及处理
将小鼠随机分为5组：正常对照组、模型对照组、超滤膜提取当归补血汤大剂量组(10 g/kg，相当于成人用量的20倍)、中剂量组(5 g/kg)、小剂量组(2.5 g/kg)，每组各10只。模型对照组和3个当归补血汤组小鼠腋下接种h32肝癌瘤株细胞悬液(2×107/mL)0.2 mL［5］。接种24 h后，3个当归补血汤组给予等容积(2 mL/100 g)的相应浓度药液灌胃，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃，每日一次，连续15 d。
1.3.2 ELISA法测定荷瘤小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ的含量
常规制备小鼠脾淋巴细胞悬液，加入24孔板中，每孔0.9 mL，同时加入含ConA的1640培养液100 μL，置37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养36 h，收集上清液，按试剂盒说明书操作测定IL-2和IFN-γ的含量。
1.3.3 RT-PCR法测定荷瘤小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达
总RNA的提取：按说明用Trizol试剂提取细胞总RNA，溶于适量DEPC处理过的双蒸水，紫外分光光度计定量和纯度检验，-20 ℃保存备用。一步法RT-PCR：反应体系总体积为50 μL，内含0.1 u/μL AMV RTase，5 mmol/LMgCl2，0.8 u/μL RNase inhibitor，0.1 u/μL Taq酶，10 μmol/L 3′及5′引物，RNA样品100 ng。逆转录反应条件：45 ℃ 30 min；然后85 ℃ 7 min灭活逆转录酶。
PCR反应循环参数设置为：变性温度85 ℃ 1 min；退火温度55 ℃ 1 min；延伸温度72 ℃ 2 min；共35个循环。72 ℃保温7 min；4 ℃保存。PCR产物的定量：取RT-PCR产物5 μL，20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为内参同时扩增并电泳。凝胶成像仪记录图像并对凝胶上每一条带进行吸光度扫描定量，结果用各组的吸光度与β-actin的吸光度之比表示。实验重复3次。
1.3.4 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐时选用LSD(least-significant difference)法，方差不齐时选用Dunnett’s法，两组间比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ含量的影响
超滤膜提取当归补血汤各剂量组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-2和IFN-γ的含量均高于模型对照组，其中当归补血汤大剂量组的含量明显高于模型对照组(P&<0.05)，模型对照组小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ的含量较正常对照组明显降低(P&<0.05，表2)。表2 超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-2和IFN-γ含量的影响（略）
2.2 超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达的影响
电泳图显示，内参β-actin的mRNA表达恒定；超滤膜提取当归补血汤各剂量组IL-2和IFN-γ mRNA的条带亮度均较模型对照型增强，其中大、中剂量组小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的条带亮度明显增强(图1)。各标本mRNA条带的吸光度参数与内参基因(β-actin)mRNA条带的吸光度的比值结果显示：超滤膜提取当归补血汤各剂量组小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达均高于模型对照组，其中大、中剂量组表达明显增高(P&<0.05)；模型对照组小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达与正常对照组比较明显降低(P&<0.05，表3)。表3 超滤膜提取当归补血汤对荷瘤小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA表达的影响（略）
3 讨论
当归补血汤的有效成分为当归多糖及阿魏酸、黄芪异黄酮、黄芪异黄烷、黄芪甲苷、黄芪皂苷等非多糖成分，其有效成分的分子质量大多小于5万［6］。本实验采用孔径为10万分子质量的超滤膜分离提取当归补血汤，可有效去除杂质，保留其有效成分，提高其质量与稳定性，为研究中药有效成分的提取奠定了一定实验基础。
研究结果表明，超滤膜提取当归补血汤能够促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌及其mRNA的表达，从而发挥免疫调节作用。IL-2和IFN-γ是细胞因子网络中重要的调节因子，在抑制肿瘤细胞生长及免疫调节方面发挥着重要作用。这也是超滤膜提取当归补血汤抗肿瘤及调节免疫的途径之一。IFN-γ是重要的抗肿瘤细胞因子，可抑制肿瘤细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬功能和巨噬细胞ADCC效应，同时又能激活NK细胞以杀伤肿瘤细胞，还能协同其他细胞因子加强抗肿瘤作用。T细胞产生IFN-γ和集落刺激因子(CSF)等多种细胞因子能诱导T细胞IL-2受体的表达。因此，IL-2和IFN-γ是诱导CTL增殖和分化必不可少的细胞因子，在机体免疫监视及肿瘤免疫方面发挥重要协同作用。IL-2和IFN-γ的分泌增多可能是增强CTL细胞毒效应的重要因素之一。这也进一步说明抗原处理相关转运蛋白(TAP)主要通过激活T细胞功能和CTL的杀伤作用从而抑制肿瘤生长。促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌可能是超滤膜提取当归补血汤免疫调节、抗肿瘤的直接作用，也可能是通过其他细胞因子而发挥的间接作用，其确切机制还有待进一步研究。
参考文献
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［2］李淑莉，刘振丽，宋志前. 超滤法在中药制剂纯化工艺中的应用研究进展 ［J］. 中药材， 2003， 26(12):898-900.
［3］潘晓鸥，李健，宋毅，等. 超滤法在中药分离、纯化工艺中的应用进展 ［J］. 华西医学， 2004， 19(2):351-352.
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［5］梅龙，董晓慧，段刚，等. 参芪注射液对h32荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(3):280.
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