作者：马力通，李珺，李雅丽，王玉炯
【摘要】 目的 探讨宁夏汉族人群中甘露糖结合凝集素(MBL)基因多态性与乙型肝炎的相关性。方法 应用PCR-RFLP方法检测111例宁夏汉族健康人、82例乙肝患者的MBL基因的多态性分布，并与其他汉族人群MBL基因多态性的分布进行比较。结果 在宁夏汉族人群中，只检测出两种等位基因：野生型A和变异型B，未检出变异型C、D等位基因，发现健康人与乙型肝炎患者MBL基因多态性分布无显著性差异。结论 MBL基因多态性与乙型肝炎不相关，但宁夏汉族MBL基因多态性与广东汉族相比有显著性差异。
【关键词】 乙型肝炎；甘露糖结合凝集素；基因多态性
ABSTRACT: Objective To explore the association between the hepatitis B virus (HBV) infection and mannose binding lectin (MBL) gene polymorphisms in Han population in Ningxia. Methods MBL was genotyped using PCR-RFLP in 82 patients affected by HBV and 111 unrelated controls from Ningxia. And we compared the genotype and allele frequency of MBL in different Han population in China. Results We only found the A and B allele. There were no significant differences in MBL polymorphism distribution in patients and controls. Conclusion There was no association between MBL polymorphism and hepatitis B. And there was significant difference in MBL polymorphism distruibution among the Han population in Ningxia and Guangdong.
KEY WORDS: hepatitis B virus (HBV); mannose binding lectin (MBL); gene polymorphism
甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin， MBL)是参加天然免疫的宿主防御分子，它能够通过凝集素途径激活补体系统和吞噬作用从而在宿主免疫防御中发挥重要作用［1］。迄今为止，所发现的MBL基因结构区突变均为第1外显子的点突变，分别是密码子54(GGC→GAC，Gly→Asp)、57(GGA→GAA，Gly→Glu)以及密码子52(CGT→TGT，Arg→Cys)(简称为MBL-54、MBL-57和MBL-52，相应突变的等位基因命名为B、C、D，野生型为A)，这些基因的突变干扰了MBL形成稳定的功能性的多聚体，使血清中MBL水平下降，从而导致了调理缺陷，这与临床反复感染、乙型肝炎、系统性红斑狼疮以及艾滋病等多种疾病的发生相关［2］。MBL基因点突变存在种族差异。目前，尚无宁夏汉族人群MBL基因突变类型及其频率研究的报道，并且国内外近年就MBL多态性与乙型肝炎相关性的研究，结论不一。为此我们对宁夏地区汉族乙型肝炎患者MBL基因多态性进行检测，以确定该多态性与乙型肝炎发病之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
111名无血缘关系的健康个体均来自于宁夏地区，其中男性74名，女性37名，年龄在6-69岁之间，其父母均为宁夏汉族。在知情同意的原则下，抽取研究个体的外周静脉血待用。
82例血清标本均采自宁夏回族自治区人民医院2005年6月至2005年10月间住院部收治的乙肝患者，其荧光定量PCR检测HBV-DNA均为阳性。其中男53例，女29例；年龄2-68岁，平均年龄36岁。诊断标准均符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》［3］。所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混合感染。标本均-20 ℃保存待用。
1.2 MBL基因的扩增
参照文献［4］提取外周血基因组DNA，以所提取基因组DNA作为模板扩增MBL基因外显子1，参照文献［5］设计引物，引物由华美生物公司合成。引物序列为：Forward：5′-AGTCGACCCAGATTGTAGGACAGAG-3′，Reverse：5′-AGGATCCAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3′。PCR反应体系为20 μL：基因组DNA 1.5 μL， 10×PCR Buffer 2 μL，2 μmol/L引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6μL，5 u/mL Taq DNA聚合酶0.2 μL，10.7 μL ddh3O。
PCR反应条件为①MBL54和MBL 57的反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环；最后72 ℃ 5 min。②MBL52的反应条件：在密码子52位处利用SDM-PCR引入一个新的酶切位点MluⅠ，其PCR反应条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，28个循环；最后72 ℃ 5 min。PCR扩增产物20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下观察结果。
1.3 限制性内切酶酶切
酶切反应体系15 μL：PCR扩增产物1.5 μL，Buffer 2 μL，BSA 0.2 μL，限制性内切酶0.2 μL，ddh3O 11.1 μL。PCR扩增产物分别被BanⅠ、MboⅡ、MluⅠ于50 ℃、37 ℃、37 ℃酶切4-5 h。酶切产物经80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后常规银染，凝胶成像仪观察结果并拍照。
1.4 统计学处理
计算出宁夏汉族MBL基因的各种基因型频率和等位基因频率，使用SPSS12.0软件进行数据统计处理，利用χ2检验分析MBL基因多态性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，各组间差异采用行列表χ2检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MBL基因多态性PCR-RFLP结果 见图1。
2.2 MBL基因多态性与乙型肝炎的相关性 在宁夏汉族人群中只检测出两种等位基因：野生型A和变异型B(54位密码子由GGC→GAC)，未检出变异型C、D等位基因。经χ2检验，符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明本研究人群具有群体代表性。HBV患者组与健康对照组之间MBL基因多态性分布比较不存在显著性差异(P&>0.05，表1)；HBV患者组按照血清学检测结果分为大三阳组和小三阳组，两组之间MBL基因频率接近，与健康人相比亦无明显差异(表1)。表1 HBV患者组与对照组MBL基因多态性的分布（略）
2.3 与其他汉族人群MBL基因多态性分布的比较
宁夏汉族与广东汉族［6］均只检出A、B两种等位基因，经χ2检验，宁夏汉族与广东汉族之间MBL基因多态性分布有显著性差异(P&<0.05，表2)，并且前者B的等位基因频率明显高于后者。表2 中国两地汉族MBL基因多态性分布情况（略）
3 讨论
MBL是第一个被发现的具有防御功能的C型凝集素。编码MBL的基因含有4个外显子，分别编码N-端富含半胱氨酸区、胶原样区、颈区和糖识别区。其中外显子1编码N-端富含半胱氨酸区和部分胶原区。MBL结构基因外显子1第52、54、57位的突变使其产物不能形成稳定的功能性的多聚体结构，从而造成MBL不能发挥调理作用和激活补体凝集素途径的作用。人群中MBL的基因突变率很高，并且MBL结构基因各点突变的基因频率与种族有关。南部非洲人以57位密码突变多见。MBL-54突变主要发生在欧洲、亚洲人群中，而在黑人中MBL-54突变极罕见。MBL-52突变少见且种族差别不明显。国内外近年来已在几个种族人群中研究MBL基因多态性与感染性疾病、自身免疫性疾病的相关性［7］。
HBV的表面抗原(HBsAg)上具有丰富的甘露糖末端寡糖链，可能是供MBL结合的靶位，故可通过血清MBL与HBV的结合而进行调理作用［8］。Thomas等［9］发现在高加索慢性HBV感染患者中，MBL密码子52突变率为27%，急性肝炎患者为11%，亚洲慢性肝炎患者为5%，在高加索人群中52位密码子突变和慢性乙肝感染(其他基因没有突变)存在正相关，但在亚洲人群中不相关。Song等［10］对所收集的123例越南HBV感染者研究发现仅MBL54位密码子发生突变，突变频率高于正常对照，且与转氨酶升高密切相关。但HBV临床各期的基因频率没有显著区别，而急性HBV患者MBL54位密码子的突变频率明显高于健康对照组，指出MBL基因突变可能影响HBV感染临床症状的出现。Yuen等［11］对香港患者的研究发现，慢性乙肝患者血清MBL水平较正常人低下，MBL密码子54突变与慢性HBV感染的易感性不相关，但与慢性HBV感染者的疾病进展相关。MBL在病毒性肝炎中的作用有待进一步澄清。
我们的研究结果表明，三种MBL基因型在HBV感染者中的分布频率AA∶AB∶BB为0.719 5∶0.256 1∶0.022 4，与正常人群频率比较无明显差异，表明MBL基因并不影响人体对乙肝病毒的易感性。乙型肝炎血清学标志检测是诊断乙型肝炎的主要方法。感染HBV后有几十种临床表现模式，但最多见的是“大三阳”(HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性)和“小三阳”(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性，包括HBsAg与抗-HBc阳性的小二阳)。我们分组后的结果显示，在大三阳组和小三阳组之间MBL基因频率大致相同，与正常人相比亦无明显差异。这一结果进一步提示MBL基因多态性与HBV的感染不相关。详细机制有待于进一步研究。
国内对汉﹑维﹑蒙﹑藏﹑彝族的研究中未发现MBL-52，MBL-57的基因突变，但是MBL-54的基因突变却很常见［12］。本文所取样本为一般人群，除了要求为汉族外，未作任何限制，故可以代表宁夏地区的汉族人群。本实验确定了宁夏汉族人群MBL基因多态性位点等位基因的分布情况，研究结果显示，宁夏汉族人群与文献［6］中的广东地区汉族相比较，MBL基因多态性分布差异显著，并且宁夏汉族人群B的等位基因频率明显高于后者。汉族是中华民族的主要成员。汉族的形成和发展，经历了一个十分复杂的融合、迁移的历史过程，是历史上融合了许多古代的非汉族人群而形成的。杜若甫等［13］认为以长江为界，中国汉族人群分南、北两大类型。各地汉族与当地的少数民族在遗传结构上十分相近，而南、北方汉族的遗传结构却相差甚远，接近于南、北方少数民族间的平均差异。宁夏汉族MBL基因多态性分布与广东汉族［5］相比有明显差异，证实了同一人种内部MBL各等位基因分布存在地理差异，也进一步支持中国汉族人群可分为南北两类的假设。
参考文献
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