药物在大鼠主动脉组织及其培养细胞的细胞膜色谱研究

【摘要】 目的 比较细胞膜色谱法中细胞膜固定相的特异性。方法 分别构建大鼠主动脉组织匀浆细胞膜固定相和培养大鼠主动脉平滑肌细胞膜固定相。用细胞膜色谱法研究10种αAR激动剂和拮抗剂的生物亲和作用，测定其容量因子并进行相关性分析。结果 10种药物在大鼠主动脉组织和培养大鼠主动脉平滑肌细胞膜固定相上容量因子之间存在正相关关系，相关系数r=0.923，有极显著性意义(P&<0.01)。结论 用培养的细胞制备细胞膜固定相具有更高的特异性，可提高药物的保留时间，也可用于药物的高效初筛。

【关键词】 细胞膜 色谱 α肾上腺素受体

　　ABSTRACT: Objective To compare the specificities of the cell membrane stationary phases (CMSP) with cell membrane chromatography (CMC). Methods Cell chromatographic columns were constructed for both rat aorta tissue cells and cultured rat aorta smooth muscle cells. Then the chromatographic affinities of ten ligands of αadrenergic receptor (αAR) with both said chromatographic columns were investigated. Capacity factors (k＇)， as a chromatographic parameter， were calculated. Results The correlation analysis showed a positive correlation between the rat aorta tissue CMSP and the cultured rat aorta smooth muscle cell CMSP， with correlation factor of r=0.923， P&<0.01. Conclusion By improving the specificity with the CMSP of cultured rat aorta smooth muscle cell， the enhanced CMC method is capable of affinities for evaluating ligandreceptors or drug screening.

　　KEY WORDS: cell membrane; chromatography; αadrenergic receptor

　　细胞膜色谱法 (cell membrane chromatography， CMC)是研究受体与药物相互作用的新型亲和色谱技术，将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合，利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力，成功地将药物体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟[14]。CMC法与放射性配体结合法和受体功能分析方法的相关性研究证明，三种方法得到的配体及其异构体对M、α、β受体亲和力顺序基本相同，并具有明显的相关性[57]。为了研究组织器官和培养细胞制备的细胞膜固定相(cell membrane stationary phrase， CMSP)的异同，本次实验将CMC法与细胞生物学方法相结合，用大鼠主动脉组织和其培养细胞CMC法研究了10种不同αAR激动剂与拮抗剂的生物亲和作用。比较了传统的CMC法(CMSP为组织细胞膜)与改进后的CMC法(CMSP为培养细胞)的特异性和相关性。建立了大鼠主动脉平滑肌培养细胞的CMC模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品和试剂 羟甲唑啉(Oxymetazoline 296.84)、5甲基乌拉地尔(5methylurapidil， 5MU 401.5)购自RBI公司；RS17053(449)购自Roche Bioscience；去甲肾上腺素(Norepinephrine 319.3)、哌唑嗪(Prazosin 419.9)、酚妥拉明(Phentolamine 317.8)、苯肾上腺素(Phenylephrine 203.7)、甲氧明(Methoxamine 247.7)、育亨宾(Youhimbin 390.9)、BMY7378(458.4)购自Sigma公司。DMEM干粉培养基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氢钠(Nah3PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、NaCl、盐酸(HCL)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均为国产分析纯。

　　1.2 实验动物 SD大鼠3只，体重100-150g，雌雄不拘，年龄2-3个月。由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.3 仪器 Gilson高效液相色谱系统，包括370泵、115型紫外检测器、7725型手动进样阀(美国Rheodyne公司)和Anastar色谱工作站(奥泰科技有限公司)；HERMLE ZK410型低温冷冻高速离心机(德国)；AS5150A超声振荡仪(Auto Science公司)；PHS2D型酸度计(上海第二分析仪器厂)；Shimadzu TB85型循环水浴(瑞士)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 大鼠主动脉组织细胞膜制备 取两只SD大鼠，颈椎脱臼处死，迅速开胸，取出主动脉，置于冷的生理盐水中，清洗数次，洗净余血，用锋利眼科剪除去主动脉壁周围的脂肪及结缔组织。将主动脉在匀浆管中剪碎，加入10倍量冷生理盐水，制备匀浆。制得的匀浆在400×g离心10min，弃去沉淀，上清液10000×g离心10min。沉淀再以生理盐水反复洗涤离心，直至沉淀为均匀的乳白色，然后加入一定量的低渗液，超声振荡20min，12000×g离心10min，弃去上清液，沉淀即为所需主动脉细胞膜。上述操作均在0-4℃下进行。

　　1.4.2 大鼠主动脉组织色谱柱的制备 取经活化处理的硅胶0.3g，作为细胞膜的载体置于低温反应管中，在抽真空和震荡条件下，分别加入上述细胞膜悬液，反应1h后，加入适量生理盐水稀释，在25℃条件下，使细胞膜磷脂双层自融合，直至在硅胶载体表面形成均匀的细胞膜。低速离心除去上清液，载体细胞膜用TrisHCL缓冲溶液洗涤，除去未结合的细胞膜。

　　1.4.3 培养的大鼠主动脉平滑肌细胞膜的制备 大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养[89]采用组织贴块法。取SD大鼠，颈椎脱臼处死，在无菌环境中迅速剪取胸主动脉，移入盛有无菌培养液的平皿中。用眼科剪子将动脉纵行剖开，内膜面向上，用眼科小弯镊轻轻刮去内皮细胞，用钟表镊细心撕下中膜的内中层，使其成1mm×1mm左右的血管片，用滴管移入事先铺好血清的培养瓶内，均匀种植。放入37℃ CO2培养箱中4-6h后将培养瓶翻转，加入4mL含20%(体积分数)小牛血清的DMEM培养液，使组织块浸入培养液中，静止5d。10d后可见细胞从植块边缘萌出。待20d左右细胞融合成片长满瓶底。用2.5g/L(0.25%)胰蛋白酶和0.2g/L(0.02%)EDTA混合消化液，按常规方法消化。终止消化后放入含少许小牛血清的离心管中离心(1000×g离心8min)。倾去上清液，添加适当培养液吹打后分瓶，5d左右细胞长满瓶底，再次依法作传代培养。实验采用第3-5代血管平滑肌细胞。当细胞覆盖瓶底50%时，可将细胞取出制膜。将消化好的细胞悬液在1000×g离心10min。弃去上清液，加入一定量的低渗液，超声振荡20min，400×g离心10min。弃去沉淀，上清液12000×g离心10min后，沉淀既为所需细胞膜。

　　1.4.4 大鼠主动脉平滑肌细胞色谱柱的制备 大鼠主动脉平滑肌细胞色谱柱用上述的培养细胞的细胞膜制备(方法同1.4.2)。

　　1.4.5 10种αAR配体在两种CMSP上的亲和力　色谱条件：柱温为37℃，流速为0.5mL/min。用pH＝7.4的50mmol/L磷酸盐缓冲液作为流动相，平衡3-4h后，将药物分别添加到流动相中进样分析(紫外检测波长为220-280nm)。

　　2 结果

　　2.1 10种αAR配体在CMSP上的亲和力 用50mmol/L磷酸盐缓冲液分别平衡大鼠主动脉组织及其培养平滑肌细胞膜色谱柱3-4h后，根据每种药物的紫外检测波长测定结果进样分析。药品均用三蒸水溶解，质量浓度均为1g/L，每种药物分别进样3次，取平均值后计算不同药物在主动脉组织CMSP上的容量因子k＇(表1、表2)。

　　表1 药物在大鼠主动脉组织CMSP上的色谱作用参数（略）

　　Table 1 Chromatographic parameters of the drugs on rat aorta tissue cells CMSP column

　　capacity factors were calculated from k＇=(tR- t0)/ t0， where tR is retention time of ligands， t0 is retention time of solvent. CV=s/×100%; CMSP: cell membreme stationary phase; BMY7378: (8[2[4(2methoxyphenyl) 1piperazinyl] ethyl] 8azaspirol[4.5]decane7，9dione); RS17053: (N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl] 5chloroα， αdimethyl1Hindole3ethanamine hydrochloride)

　　表2 药物在大鼠主动脉平滑肌细胞膜CMSP上的色谱作用参数（略）

　　Table 2 Chromatographic parameters of the drugs on cultured rat aorta smooth muscle cells CMSP column

　　Capacity factors were calculated from k＇=(tR- t0)/t0， where tR is retention time of ligands， t0 is retention time of solvent. CV=s/×100%; CMSP: cell membreme stationary phase; BMY7378: (8[2[4(2methoxyphenyl) 1piperazinyl] ethyl] 8azaspirol[4.5]decane7，9dione); RS17053: (N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl] 5chloroα，αdimethyl1Hindole3ethanamine hydrochloride)
　　
　　在实验所用不同的αAR激动剂和拮抗剂中，酚妥拉明为非选择性α受体拮抗剂；哌唑嗪为α1选择性拮抗剂，对α2的作用很弱，亲和力为α1的1/1000；5甲基乌拉地尔、RS17053为α1A受体选择性拮抗剂；BMY7378为α1D受体选择性拮抗剂；去甲肾上腺素为α受体激动剂；甲氧明为α1受体激动剂；苯肾上腺素为α1受体激动剂；育亨宾为α2受体拮抗剂。由表1、表2可见，药物在大鼠主动脉组织细胞CMSP上的保留时间由长到短依次为：哌唑嗪、5MU、酚妥拉明、BMY7378、羟甲唑啉、RS17053、育亨宾、甲氧明、去甲肾上腺素、苯肾上腺素。容量因子分别为：5.673、4.183、2.841、2.696、2.544、2.260、1.943、1.331、1.068。用培养主动脉平滑肌细胞制备的CMSP得到的αAR激动剂和拮抗剂的亲和力顺序由大到小分别为：哌唑嗪、酚妥拉明、5MU、羟甲唑啉、BMY7378、育亨宾、甲氧明、苯肾上腺素、去甲肾上腺素、RS17053。容量因子分别为：20.037、9.865、8.758、7.390、5.793、4.304、1.187、0.876、0.669、0。

　　2.2 药物在两种CMSP模型上的容量因子(k)相关性的比较 相关分析表明：药物在大鼠主动脉组织、培养大鼠主动脉平滑肌细胞CMSP上容量因子之间存在正相关关系，相关系数r为0.923，相关系数有极显著性意义(P&<0.01)。

　　3 讨论
　　
　　本次实验研究了αAR激动剂和拮抗剂在大鼠主动脉组织细胞和其培养细胞制备的CMSP上的亲和力。建立了大鼠主动脉平滑肌细胞CMC模型。除了药物RS17053在主动脉组织上的亲和力强于培养的主动脉平滑肌细胞以外，其余药物在这两种CMSP上的总体趋势是一致的。 培养的主动脉平滑肌细胞是主动脉血管的中膜部分，不仅纯化了细胞，而且不含有内皮细胞。可能是RS17053与主动脉内皮细胞上多种受体的亲和力较强。说明用组织器官和培养细胞制备CMSP的方法结果是一致的，只是用培养的主动脉平滑肌细胞制备细胞膜固定相后可以提高固定相上受体的纯度和密度，延长药物在色谱柱上的保留时间。
　　
　　已有的研究表明大鼠主动脉的主要功能α1AR属于α1D亚型，而大鼠肾动脉的主要功能α1AR属于α1A亚型[1012]。韩启德教授的课题组采用RNA酶保护分析与定量液相杂交方法显示在大鼠主动脉α1AR mRNA的水平尽管以α1D亚型最高(占57%)，但α1A与α1B亚型同样有mRNA的表达[13]。这个结论与我们用CMC法得出的实验结果相符：α1DAR、α1AAR高选择性药物在大鼠主动脉组织色谱柱上均有保留，但亲和力大小不同。
　　
　　最初认为α2AR仅存在于阻力血管平滑肌而不存在于大血管，是根据在完整器官灌流条件下能显示突触后α2AR增加灌流压的效应，而在离体血管标本则测不到α2AR介导的缩血管效应。随着放射配体结合分析技术的产生与应用，现在证实除阻力血管外，不少大血管平滑肌中确实存在功能性α2AR。本次实验选用α2AR高选择药物育亨宾，通过CMC法也证明了在主动脉血管上存在α2AR。

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