大鼠脑发育过程中神经型一氧化氮合酶的表达变化

【摘要】 目的 用免疫组化方法探讨神经型一氧化氮合酶在大鼠脑发育过程中的表达变化。方法 分别随机选取E12、E15、E18、P0、P5及P10期的SD大鼠，应用免疫组化方法，检测大脑皮层、纹状体及海马nNOS阳性细胞的密度。结果 E12、E15及E18期大鼠脑组织未见nNOS阳性细胞；大脑皮层及纹状体区P0、P5及P10期均可见nNOS阳性细胞。nNOS阳性细胞密度，在P0、P5及P10期逐渐降低，两两比较，有显著性差异(P<0.05)。P0期海马偶见nNOS阳性细胞，P5期和P10期均可见较多nNOS阳性细胞，但nNOS阳性细胞密度P5和P10期之间无统计学差异(P>0.05)。结论 胚胎期大鼠脑内nNOS染色呈阴性反应；生后大脑皮层及纹状体nNOS阳性细胞密度逐渐减小，海马nNOS阳性细胞密度则有所增加。

【关键词】 神经型一氧化氮合酶(nNOS) 免疫组化 脑发育 大鼠

　　ABSTRACT: Objective To observe the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) during the growth of brain in rats with immunohistochemical method. Methods Fetal and newborn rats were randomly selected， and pided into 6 groups according to developmental stages of E12， E15， E18， P0， P5 and P10. The sections were stained by nNOS immunohistochemical staining. The density of nNOS immunoreactive cells was collected and measured by image gathering and analysis software in the sections of cerebral cortex， striatum and hippocampus. Results nNOS immunoreactive cells were not found at telencephalon in fetal rats. In newborn rats， the density of nNOS immunoreactive cells was the highest at P0 in the cerebral cortex and striatum， and reduced sequentially at P5 and P10. In the hippocampus， the number of nNOS immunoreative cells at P5 and P10 was obviously larger than that at P0. There was no significant difference between P5 and P10. Conclusion nNOS immunohistochemical staining is negative at telencephalon in fetal rats.With the development of the cortex and striatum， the expression of nNOS declines in newborn rats. However， it increases in the hippocampus during the growth.

　　KEY WORDS: neuronal nitric oxide synthase (nNOS); immunohistochemistry; brain development; rat

　　在神经系统中，一氧化氮(nitric oxide， NO)不仅在神经细胞间起着神经递质的作用，而且是中枢神经系统的信使物质，可能与脑细胞的发育、脑细胞的学习和记忆过程及脑缺血时调整脑血供应等有关。近年来，与NO合成相关的一氧化氮合酶(NOS)越来越受到研究人员的重视。目前，在生物组织中已经确定的NOS有三种亚型，即神经型NOS(neuronal NOS， nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS， eNOS)和有病理意义的诱导型NOS(inducible NOS， iNOS)。其中脑中的nNOS主要是一种可溶性的胞质酶，分子量为150-160ku，主要在神经元中表达。本实验应用免疫组化技术，研究nNOS在大鼠大脑皮层、纹状体及海马发育过程中表达的变化，为进一步探讨其在中枢神经系统发育过程中的作用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 兔抗nNOS多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物科技有限公司，SABC即用型试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，DAB显色剂购自美国sigma公司。

　　1.2 实验动物 随机选用体重250-300g的SD大鼠雌、雄各数只，于晚8:00以后雌雄合笼，保证同一笼中只有一只雄鼠，若干雌鼠。于次日早8:00以前，雌雄分笼，并观察雌鼠阴道口。若存在阴栓，为配种成功的标志。未配种成功的雌鼠继续于当晚与雄鼠合笼，并继续观察，直至配种成功。

　　1.3 组织取材 胚鼠：将孕12、15、18d的雌鼠，按350mg/kg体重腹腔注射100g/L水合氯醛，动物麻醉成功后，开腹，寻找子宫，并迅速各取下3只胚胎，置于0.01mol/L的PBS溶液(pH 7.4)中，快速取脑，置于包氏液在4℃冰箱中固定。新生鼠：分别于生后24h以内(P0)、生后5d(P5)及生后10d(P10)随机各选取3只，迅速断头取脑，置于包氏液4℃冰箱中固定。

　　1.4 冰冻切片制备 包氏液中充分固定的脑组织，置于700mL/L酒精中充分洗脱，后置300g/L蔗糖溶液中4℃沉降，待组织沉底后，OCT包埋，入-26℃恒冷箱切片机，隔3取1制成20μm厚冠状切片，-30℃保存备用。

　　1.5 组织染色

　　1.5.1 尼氏染色 将制备好的冰冻切片吹干后，入焦油紫中孵育10min，常规水洗，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.5.2 免疫组化染色 将冰冻切片吹干后，在30mL/L h3O2溶液(甲醇配)中室温孵育15min；3mL/L Triton X100溶液中室温孵育30min；50g/L BSA室温孵育20min，甩去不洗；滴加1∶100兔抗nNOS多克隆抗体，4℃过夜；次日滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃孵育2h；滴加SABC，37℃孵育30min。以上各步骤之间用0.01mol/L的PBS溶液(pH7.4)彻底漂洗。最后DAB显色，10min左右终止显色；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.5.3 空白对照实验 用PBS替代一抗孵育切片，结果为阴性。

　　1.6 图像分析与统计方法 ImagePro Plus图像分析软件，测定大脑皮层、纹状体及海马单位面积nNOS阳性细胞的密度。采用SPSS10.0软件，数据进行正态检验符合正态分布，并运用方差分析进行统计学处理，以均数±标准差(±s)表示，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 尼氏染色结果 可见大量形态完整的神经细胞，排列紧密，胞质着蓝色，证明组织切片制备成功。

　　2.2 免疫组化染色结果 nNOS阳性染色呈棕黄色，阳性反应物分布于胞质和突起，胞核不着色，有的细胞可见较长串珠样突起。胚胎期12d(E12)、15d(E15)及18d(E18)各组大鼠脑组织切片未见nNOS阳性细胞。在新生大鼠神经系统中的大脑皮质、纹状体及海马等区域中有nNOS阳性细胞广泛分布，主要是无棘突细胞，在这些区域呈散在分布。应用图像分析软件，计算阳性染色细胞密度(个/μm2)。

　　2.2.1 大脑皮层 新生大鼠大脑皮层P0、P5及P10期均可见散在的nNOS阳性细胞(图1)。这些阳性细胞散在分布于大脑皮层的Ⅰ-Ⅵ层，为椎体形、梭形和圆形，有的细胞可见较长的棕色突起，为神经细胞伸出的树突或轴突。P0期nNOS阳性细胞密度最高，P5和P10期逐渐降低，两两之间差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

　　图1 新生大鼠大脑皮层P0、P5和P10期nNOS的免疫组化染色结果（略）

　　Fig.1 nNOS immunohistochemical staining in the cerebral cortex of newborn rats at P0， P5 and P10 by turns

　　nNOS immunoreactive cell was brown. the density of nNOS immunoreactive cell was the highest at P0(A) in the cerebral cortex， and reduced sequentially at P5(B) and P10(C). Scale bar: 100μm

　　2.2.2 纹状体 大鼠纹状体P0、P5及P10期均可见大量NOS阳性细胞(图2)。阳性细胞为圆形、三角形和梭形，胞质丰富、深染，有的细胞可见伸出的棕色树突或轴突。nNOS阳性细胞密度P0、P5、P10期依次降低，两两之间差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　2.2.3 海马 在海马中，nNOS主要存在于CA1区和CA3区的分子层及海马齿状回的门区中。实验分别对海马CA1、CA3及DG区nNOS阳性细胞密度进行统计分析，P0期仅偶见零星nNOS阳性细胞，而P5期和P10期均可见较多nNOS阳性细胞，但nNOS阳性细胞密度P5和P10期之间差异无统计学意义(P>0.05，表1、图3)。

　　图2 新生大鼠纹状体P0、P5和P10期nNOS 的免疫组化染色结果（略）

　　Fig.2 nNOS immunohistochemical staining in the striatum of newborn rats at P0， P5 and P10 by turns

　　nNOS immunoreactive cell was brown. the density of nNOS immunoreactive cell was the highest at P0(A) in the striatum， and reduced sequentially at P5(B) and P10(C). Scale bar: 100μm

　　表1 新生大鼠大脑皮层及纹状体NOS阳性细胞密度（略）

　　Table 1 The density of nNOS immunoreactive cells in the cerebral cortex， striatum and hippocampus of newborn rats (±s， piece/μm2， n=3)

　　*P<0.05， comparison between each other; **P<0.01， comparison between each other

　　图3 新生大鼠海马P0、P5和P10期nNOS免疫组化染色结果（略）

　　Fig.3 AC are results of nNOS immunohistochemical staining in the hippocampus of newborn rats at P0， P5 and P10 by turns

　　nNOS immunoreactive cell was brown. In the hippocampus， few of nNOS immunoreactive cell were found by chance at P0. The number of nNOS immunoreative cells at P5(B) and P10(C) was obviously larger than that at P0(A). There was no significant difference between P5 and P10. D was high magnification views of nNOS immunoreactive cell that arrow point to at P0. Scale bar:100μm(AC); Scale bars: 20μm(D)

　　3 讨论
　　
　　在中枢神经系统中，NO既有维持调节突触可塑性、参与神经信号转导等正常生理功能，又在一定条件下具有神经毒性作用[1]。与之相关的nNOS在神经系统中有广泛的分布，主要在神经元中表达，这些细胞主要是无棘突细胞，它们散在性地分布在整个区域。
　　
　　虽然目前涉及生物体内一氧化氮合酶的研究已有很多，但关于一氧化氮合酶与脑发育的研究并不多见。研究显示，在鼠脑发育阶段NOS与神经元的分化、迁移以及突触的形成有密切关系[2]。Matarredona等[3]的研究发现，成年小鼠脑室下区(SVZ)的神经前体细胞和喙侧神经干细胞迁移流都被表达nNOS的已分化神经细胞所围绕，而且，当一些神经前体细胞到达他们的最终分化地——嗅球时，表达nNOS。表明在神经前体细胞的增殖、迁移和分化过程中可能受到NO的影响[4]。Santacana等[5]的研究显示，在大鼠胚胎脑组织中，NO的合成与神经系统成熟过程有关，如大脑皮层的分层构建；并且与神经细胞迁移过程和神经纤维向内生长相关。同时，NO作为信息传递物质，主要参与海马长时程突触传递增强及小脑长时程突触传递抑制，此为维持正常学习记忆必不可少的两方面。
　　
　　历来关于NOS阳性细胞在大鼠胚胎脑组织中分布的研究并不一致。Bredt等[6]研究发现大鼠E15、E17和E19期大脑皮质有NOS的瞬时表达。Terada等[7]发现大鼠E15及E19期的脑组织中，间脑、桥臂、延髓、新纹状体及下丘脑有NOS阳性细胞分布，而在大脑皮层、海马和小脑几乎没有表达。Santacana等[5]的研究显示，大鼠脑组织E14期边缘带的CajalRetzius(CR)细胞首先发现有nNOS阳性表达，并且继续在胚胎期持续表达，仅在E20期开始下降。从E17期开始，中间带中向大脑皮质迁移的神经细胞表达nNOS。E19期发现在SVZ区及其附近，有正在迁移的nNOS阳性细胞。在E18和E19期，胼胝体也发现有nNOS阳性表达。
　　
　　但本实验对胚胎期大鼠端脑的免疫组化研究中，未见明显的nNOS阳性细胞，可能未能捕捉到其表达。而在新生大鼠的大脑皮质，nNOS阳性细胞密度P0、P5、P10期逐渐降低，可能与皮层神经细胞的迁移分化过程相关，为大脑皮质正常功能的发挥打下形态学基础。纹状体是锥体外系控制躯体运动的重要皮质下中枢，主要参与躯体运动的控制与调节。本实验显示，大鼠纹状体P0期的nNOS阳性细胞密度最高，P5、P10期则依次降低，提示nNOS阳性细胞与发育过程中大鼠的运动机能及调控相关。海马某些区域在受到重复刺激后可产生一种持续增强的突触效应，称为长时程增强(LTP)，是学习和记忆的分子基础。NO可作为LTP的逆行信使弥散至突触前末梢， 经一定机制对LTP效应的维持起促进作用。本实验发现P5及P10期海马nNOS阳性细胞较P0期明显增多，提示nNOS阳性细胞的增多与发育过程中学习和记忆功能的增强相关，而P5与P10期虽有较多阳性细胞，但统计学分析未见二者之间的明显差异，可能与样本含量有关。
　　
　　实验结果显示，nNOS的表达在大鼠脑发育过程中存在较大变化，提示nNOS的表达与大鼠脑发育关系密切，为下一步研究nNOS在脑发育过程中的作用提供理论依据和形态学基础，但其相关机制尚需进一步探讨。

参考文献

　　[1]白浩，崔景彬，王俊萍. 尼莫地平对阿尔茨海默病大鼠脑组织NO、NOS含量及行为学的影响 [J]. 郑州大学学报(医学版)， 2002， 37(4):428430.

　　[2]Giuili G， Luzi A， Poyard M， et al. Expression of mouse brain soluble guanylyl cyclase and NO synthase during ontogeny [J]. Brain Res Dev Brain Res， 1994， 81(2):269283.

　　[3]Matarredona ER， MurilloCarretero M， MorenoLo pez B， et al. Nitric oxide synthesis inhibition increases proliferation of neural precursors isolated from the postnatal mouse subventricular zone [J]. Brain Res， 2004， 995(2):274284.

　　[4]MorenoLo pez B， Noval JA， Gonza lezBonet L， et al. Morphological bases for a role of nitric oxide in adult neurogenesis [J]. Brain Res， 2000， 869(12):244250.

　　[5]Santacana M， Uttenthal LO， Bentura ML， et al. Expression of neuronal nitric oxide synthase during embryonic development of the rat cerebral cortex [J]. Brain Res Dev Brain Res， 1998， 111(2):205222.

　　[6]Bredt DS， Snyder SH. Transient nitric oxide synthase neurons in embryonic cerebral cortical plate， sensory ganglia， and olfactory epithelium [J]. Neuron， 1994， 13(2):301313.

　　[7]Terada H， Nagai T， Kimura H， et al. Distribution of nitric oxide synthaseimmunoreactive neurons in fetal rat brains at embryonic day 15 and day 19 [J]. J Chem Neuroanat， 1996， 10(34):273278.