肝舒汤对非酒精性脂肪肝大鼠脂质过氧化的影响

【摘要】 目的 探讨中药复方肝舒汤对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型大鼠脂质过氧化反应的影响，探讨其防治NAFLD的作用机制。方法 采用高脂饮食复制大鼠NAFLD模型。随机分为正常组、模型组、中药组、东宝肝泰组。检测血脂变化、肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及观察肝细胞超微结构。结果 模型组大鼠出现脂肪变及不同程度的炎性细胞浸润，电镜可见肝细胞内存在大量脂滴，模型组大鼠血和肝组织中MDA水平较正常组显著升高，而SOD活性则较正常组显著降低，与模型组相比中药组大鼠血清TG、LDLc明显降低；肝匀浆中MDA含量显著降低，肝细胞超微结构明显改善。结论 肝舒汤对大鼠非酒精性脂肪肝有明显的防治作用，其作用机制与其能降低血脂、改善肝脏组织脂肪变性程度、抑制脂质过氧化有关。

【关键词】 非酒精性脂肪肝 肝舒汤 氧化应激

　　ABSTRACT: Objective To observe the effects of Chinese herbs Ganshutang decoction on lipid peroxidation reaction in rats with nonalcoholic fatty liver (NAFL)， and inquire into its mechanism of preventing and treating NAFL. Methods Thirtytwo rats were randomly allocated into 4 groups: normal control group， model group， Dongbao Gantai (DBG) group and Ganshutang decoction (GSTD) group. The model of NAFLD in SD rats was induced by a term of 8week high fat diet. General condition， pathological changes of liver tissues and the ultrastructure of liver cell were observed. Blood lipids were detected. The levels of MDA and SOD of liver tissue were also measured. Results Compared with that of the normal group， the liver tissue developed steatosis and gradually infiltrated with inflammation cells， and necrosis appeared in hepatocytes. The liver ultrastructure indicated that there were many lipid droplets accumulated in the plasm of model hepatocytes. The level of MDA in liver tissue of the model group obviously increased， while the activity levels of SOD obviously decreased. Compared with that of model group， GSTD could improve the liver pathologic structure， and decrease blood lipids and liver tissue MDA significantly. Conclusion Ganshutang decoction can prevent and treat NAFL obviously， the mechanism of which may be related to preventing lipid peroxidation reaction.

　　KEY WORDS: nonalcoholic fatty liver; Ganshutang decoction; oxidative stress

　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD)是一种以无过量饮酒史而肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，其发病机制目前尚不完全明确。但是，认为脂质过氧化损伤是其发生发展的重要因素之一[1]。中药肝舒汤应用于临床治疗脂肪肝多年，对患者的症状减轻及肝功能改善均有肯定疗效。本实验通过建立大鼠NAFLD动物模型，以东宝肝泰为对照，观察中药肝舒汤对NAFLD大鼠肝脏组织超微结构、血脂及氧化活性的影响，为阐明其作用机制和应用于临床防治NAFLD提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康Sprague Dawley雄性大鼠32只，体重78-105g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。在该中心饲养、观察和研究。实验室温度(22±3)℃，湿度(55±5)%，适应性饲养1周，自由摄食(普通固体饲料)及饮水。

　　1.2 实验药物 肝舒汤：由黄连12g、半夏10g、栝楼30g、片姜黄10g、太白楤木12g等组成。药液制备：按照各药在各方中的比例准确称取，混匀，加入10倍量水，浸泡6h，加热煎煮1h，滤出药液，再加入8倍量水，煎煮1h，过滤，将两次煎煮所得药液合并，水浴浓缩成浓度为每毫升含生药2g生药量液体，冰箱储存备用。东宝肝泰片：通化东宝药业股份有限公司出品，批号430110。参照成人用量，按照动物体表面积比率关系换算成等效剂量，实验时用5g/L的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液。

　　1.3 分组与药物干预 将大鼠随机分为：正常组、模型组、中药组、东宝肝泰组。除正常对照组喂饲普通饲料外，其余各组均喂饲高脂饲料(高脂饲料配制：普通饲料+100g/kg猪油+20g/kg胆固醇)[2]。正常组、模型组：灌服1mL/100g生理盐水；东宝肝泰组：灌服5g/L的羧甲基纤维素钠配制成的东宝肝泰混悬液；中药组：灌服肝舒汤制备药液。所给药量参照成人用量，按照动物体表面积比率关系换算，每周调整一次给药剂量。

　　1.4 MDA和SOD的检测 于实验第8周，戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏采血，分离血清测TC、HDL、LDL；处死动物，迅速取出肝脏，取肝右叶1g，4℃下制成100g/L左右的肝匀浆，按试剂盒操作检测丙二醛(malondialdehyde， MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)。MDA含量测定采用硫代巴比妥(thiobarbituric acid， TBA)比色法，SOD用黄嘌呤氧化酶法，严格按试剂盒操作步骤检测。4℃下取实验组、模型组大鼠约1mm×1mm×0.2mm的肝组织(各2份)，20g/L戊二醛固定24h，10g/L锇酸固定1h，丙酮逐级脱水，epon812包埋，经电镜切片机制作成60nm厚切片，醋酸铀染色，HITCH600透射电镜观察并摄片。留取肝组织浸泡于福尔马林中固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。肝细胞脂肪变程度作以下分级[3]：重度：脂肪变肝细胞超过肝小叶2/3；中度：脂肪变肝细胞占肝小叶1/3-2/3；轻度：脂肪变肝细胞呈散在小灶分布；无：肝小叶结构完好，基本无脂肪变。炎症活动度计分标准参考1981年Knodell [4]提出的慢性肝炎组织学活动指数(hepatitis histological activity index， HAI)，并结合王泰龄等[5]提出的慢性肝炎炎症活动计分方案：分为汇管区炎症(portal inflammation， P)、小叶内炎症(lobule inflammation L)、碎屑样坏死(piecemeal necrosis， PN)、桥接坏死(bridging necrosis， BN)4项。每项根据病变程度分别计1-4分。因为PN和BN严重度与预后直接相关，所以计分2倍高于其他病变，故炎症活动度计分=P+L+2PN+2BN。

　　1.5 统计方法 所有数据均以均数±标准差(±s)表示，经统计软件SPSS 13.0处理，各测量值间比较用Oneway ANOVA方差分析法，P<0.05为具有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠肝脏病理学的变化 大体观察：正常组肝表面颜色普遍暗红，色泽鲜亮，中等硬度，切面略有颗粒感，无油腻感。模型组大鼠多数肝脏表面颜色发黄，肝脏体积明显增大，包膜紧张，部分肝脏呈奶黄色，切面油腻，有油滴，无颗粒感。中药组大鼠肝脏较正常组偏大，大部分颜色红润，个别淡黄色，切面略有颗粒感，无油腻感。东宝肝泰组大鼠部分肝脏肥厚，红黄相间，个别大鼠切面油腻，有油滴。
　　
　　光镜观察：正常组大鼠肝细胞小叶结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状分布；模型组大鼠肝细胞中度水肿，排列不规整，多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡，病变以中央静脉周围最为明显，同时肝小叶内和汇管区有以大量单个核细胞为主的炎性细胞浸润，以小叶内炎症为主，部分大鼠肝组织小叶内坏死灶融合成片；中药组和东宝肝泰组肝脏病理有不同程度的改善，其脂滴与模型组比较较小、密度稍稀，肝组织炎症分布和性质与模型组基本相似，炎症细胞浸润程度明显减轻。与正常组相比，模型组大鼠肝细胞存在明显脂肪变性和炎症活动(P<0.01)，但中药组肝细胞脂肪变性程度和炎症活动度较模型组明显减轻(P<0.05)，而且其炎症活动度也比东宝肝泰组轻(P<0.05，图1、表1)。
　　
　　电镜观察：模型组大鼠肝细胞超微结构明显异常，肝细胞索排列紊乱。肝细胞肿大变圆，胞浆内有较多的脂滴(主要是中小脂滴)，线粒体嵴肿胀，数量变少；中药组胞内脂滴明显减少，偶见线粒体肿胀；东宝肝泰组大鼠胞浆内脂滴数量与模型组相比稍有减少(图2)。

　　图1 各组大鼠肝组织组织形态学观察结果（略）
　　
　　Fig.1 Results of hepatic tissue istomorphology of each group (×400)

　　A: results of hepatic tissue istomorphology of control group. The structure of hepatic tissue was normal; B: results of hepatic tissue istomorphology of model group. The hepatocyte developed cellular edema.There were many lipid droplets in major liver cells; C: results of hepatic tissue istomorphology of GSTD group. The lipid droplets in liver cell were small and thinly scattered; D: results of hepatic tissue istomorphology of DBG group. The lipid droplets in liver cell were small and thinly scattered

　　表1 各组大鼠脂肪变性和炎症活动度的比较（略）

　　Table 1 Comparison of adipose degeneration and the activity degree of inflammation

　　**P<0.01 vs. control group; △P<0.05 vs. model group; #P<0.05 vs. DBG group; GSTD: Ganshutang decoction; DBG: Dongbao Gantai

　　图2 各组大鼠肝细胞在透射电镜下的表现（略）

　　Fig.2 The appearance of liver cells in each group by transmission electron microscope (×5000)

　　A-B: the appearance of liver cells in model group by transmission electron microscope. There were major lipid droplets in hepatic cells and mitochondria developed enlargement; C-D: the appearance of liver cells in model group by transmission electron microscope. The chromatins in hepatocyte nucleus were welldistributed and there were manipulus liqid droplets in cytoplasm

　　2.2 各组大鼠血脂指标的变化 模型组血清TG、LDLc水平比正常组均显著升高(P<0.01或P<0.05)，而血清HDLc较正常组明显降低(P<0.01)；中药组及东宝肝泰组和模型组相比，血清TG、LDLc水平均明显降低(P<0.01或P<0.05)，而中药组降低血清LDLc的效果优于东宝肝泰(P<0.01或P<0.05)。但是，对于升高血清HDLc来说，明显不如东宝肝泰组(P<0.01，表2)。

　　表2 各组大鼠血清TC、HDL、LDL的比较（略）

　　Table 2 Comparison of serum TC， HDL and LDL

　　**P<0.01 vs. control group; △P<0.05， △△P<0.01 vs. model group; ##P<0.01 vs. DBG group; GSTD: Ganshutang decoction; DBG: Dongbao Gantai

　　2.3 各组大鼠肝匀浆SOD活性、MDA含量的变化 模型组与正常组相比，MDA含量明显升高，而SOD活性明显降低(P<0.01)；中药组与东宝肝泰组MDA含量均低于模型组(P<0.05)，而和模型组相比，SOD活性无明显差异；中药组与东宝肝泰组相比，肝匀浆SOD活性及MDA含量均无显著性差异(P>0.05，表3)。

　　表3 各组大鼠肝匀浆MDA、SOD的比较（略）

　　Table 3 Comparison of MDA and SOD in liver tissue

　　**P<0.01 vs. control group; △P<0.05 vs. model group; GSTD: Ganshutang decoction; DBG: Dongbao Gantai

　　3 讨论
　　
　　本实验采用以基础饲料+100g/kg猪油+20g/kg胆固醇喂养雄性SD大鼠，对大鼠肝脏病理变化进行了观察，结果提示实验动物出现超质量、高胆固醇血症、肝组织HE染色造模8周大鼠肝脏弥漫性肝细胞脂肪变性，呈以小泡性为主的混合性脂肪变性，部分标本还出现小叶内炎症细胞浸润和散在的点状坏死，其肝细胞脂肪变性达到脂肪肝诊断标准[6]。说明通过上述高脂饲料成功建立了普通SD大鼠的NAFLD模型。
　　
　　NAFLD的发病机制尚不明确，但以氧应激和脂质过氧化为轴心的“二次打击学说”已得到大多数人的认同。认为初次打击主要为胰岛素抵抗(IR)，二次打击主要为反应性氧化代谢产物增多，导致脂质过氧化伴细胞因子、线粒体解偶联蛋白2和Fas配体被诱导活化，进而引起脂肪变性的肝细胞发生炎症、坏死甚至纤维化[7]。氧应激是因为前氧化物和抗氧化剂之间失平衡造成，前氧化物产生过多，超过SOD、还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素E等组成的抗氧化系统的清除能力，导致需氧细胞损伤。而前氧化物的主要来源即是线粒体产生的反应性氧(ROS)。高脂饮食使机体内过量的脂肪在肝实质内积累，肝摄取脂肪酸过多，产生大量的ROS，可通过传递电子直接氧化细胞大分子物质，破坏细胞功能及其完整性，损伤线粒体并导致呼吸链功能障碍，从而产生更多的ROS，使脂质过氧化进一步增强，又进一步干扰肝内脂类代谢，形成恶性循环。导致氧应激的可能因素还有肝组织微粒体氧化酶CYP4502E1和CYP4A表达增多、肝组织铁负荷过重、炎性细胞浸润激活等。MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量的高低反映了过氧化损伤的程度。SOD可清除自由基，减轻和阻断脂质过氧化作用，为体内重要的抗氧化物质，其活性大小与抗氧化能力呈正相关[89]。本研究发现，模型组大鼠肝组织匀浆中MDA水平显著高于正常组，而SOD活性较正常组明显下降，表明NAFL大鼠存在着显著的氧应激和脂质过氧化反应增强。这也表明脂肪肝的发生与抗氧化能力受损有关[10]。
　　
　　目前，对于防治该病药物的确切实验和临床疗效也存在颇多争议。从中医对脂肪肝的研究现状看，病因不外肥甘厚味、生冷酒醴、饥饱失常、劳逸过度等导致脾胃运化失常，水津不能正常敷布，聚而成湿，湿聚成痰，蕴久化热；肝气失于疏泄，则气机郁滞，湿痰交阻亦影响气机升降之枢，气滞不能推动血液运行，则血液凝滞。肝舒汤就是在“清热祛痰疏肝”的治法指导下，有机的将辩证与辨病相结合，选取小陷胸汤为基础方，此方即典型的痰热方。半夏，痰饮之常用药，体滑性降，而不免于辛温，配合黄连、瓜蒌，则辛以开结，寒以泄热，能通能降，药虽寥寥三味，却至精至当。在临床应用中加姜黄可入肝脾二经，能行气疏肝活血。该药经现代医学药理研究证实其降脂活性成份为姜黄色素，可明显抑制肝中TG和TC，亦可显著促进胆汁的排泄量。另加入陕西省特有药材太白楤木(Aralia ChinesisL)，属楤木属，为五加科植物，民间称为飞天蜈蚣七，有祛风除湿、清热镇痛、活血散瘀、利尿消肿、补气安神及保肝作用；现代药理显示有降脂，抗缺氧的药理特性，调节脂肪肝肝细胞线粒体ROS。本实验研究表明，肝舒汤可显著降低血清TG、LDLc、升高HDLc以及肝组织匀浆MDA水平，进而改善肝脏组织脂肪变性程度并改善肝细胞线粒体膜流动性，保护肝筛结构和功能，减少ROS泄漏，抑制脂质过氧化、阻止脂质过氧化物的产生，对NASH有明显的防治作用。

参考文献

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