虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病作用及其可能的分子机制

【摘要】 目的 探讨白藜芦醇在体外对白血病细胞的抑制作用及其分子机制。方法 MTT比色法测定细胞生长抑制率；流式细胞术、HE染色、激光共聚焦显微镜等方法观察各组白血病细胞的细胞周期与细胞凋亡情况；Western Blotting法测定细胞抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平；免疫组织化学法测定白血病细胞信号转导分子pSTAT3的活性表达。结果 白藜芦醇可以时间剂量依赖的方式抑制3种白血病细胞增殖、诱导凋亡、影响细胞周期分布、减弱STAT3的酪氨酸磷酸化活性。结论 白藜芦醇对不同来源的白血病细胞均具有较强的抗肿瘤活性，显著减少STAT3的酪氨酸磷酸化活性，为其进一步应用于白血病的临床治疗积累了实验依据。

【关键词】 白藜芦醇 细胞凋亡 白血病

　　ABSTRACT: Objective To explore the antileukemia effects of resveratrol on three leukemia cell lines HuT78， Jurkat and L1210 in vivo. Methods MTT colorimetry was used to measure the tumor cell growth repression rate. The level of Bcl2 was measured by Western blotting. The cell cycle of cells was analyzed by flow cytometry. The expression of pSTAT3 was determined by immunohistochemistry. Results Our findings indicated that resveratrol could inhibit proliferation， induce apoptosis， and influence cell cycle of HuT78， Jurkat and L1210 cells in a dose and timedependent manner and reduce the expression of pSTAT3 in vitro. Conclusion Resveratrol might have a chemotherapeutic potential for leukemia of various sources and reduce the expression of pSTAT3 which provides experiment evidence for its application in clinical treatment of leukemia.

　　KEY WORDS: resveratrol; apoptosis; leukemia

　　白血病是一种常见的造血组织恶性疾病，起源于造血干细胞的基因突变，化疗是目前治疗本病的主要手段。但是，化疗药物治疗白血病时往往也杀伤正常细胞，给机体的正常组织器官，特别是对骨髓和消化道造成功能性或器质性的损伤。此外，对化疗药物的耐受性也是白血病化疗失败的主要原因之一[1]。因此，迫切需要找到治疗白血病等全身性肿瘤的更好办法。祖国医学对肿瘤早有认识，主张辨证施治，强调整体观念。中药既能直接杀伤肿瘤细胞，也可以扶正固本、提高机体自身的抗肿瘤能力。本实验选用的反式白藜芦醇(transresveratrol)取自陕西地区中药虎杖，其有效成分白藜芦醇的提取率较高[2]。白藜芦醇化学名称芪三酚，属非黄酮类多酚化合物，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素。虽然白藜芦醇的抗肿瘤作用已经在诸多细胞系中得到证实，但是具体应用剂量在不同的研究中存在较大差异。本研究选择3种不同来源的细胞白血病细胞株作为研究对象，采用多种研究方法，以图较为科学、全面地探讨白藜芦醇抗白血病作用及其可能的分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与细胞 白藜芦醇(纯度98.36%)购自陕西赛德生物股份有限公司；MTT购自Sigma公司；RPMI 1640、 胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；抗人(鼠)Bcl2抗体购自Labvision公司；抗鼠(人)pSTAT3多克隆抗体购自Santa Cruz公司；Annexin VFITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司；小鼠淋巴细胞白血病细胞株(L1210)由西安交通大学生命科学与技术学院王一理老师惠赠；人皮肤T细胞淋巴瘤(HuT78)、人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat， Clone E61)由西安交通大学医学院第一附属医院陈颖老师惠赠。

　　1.2 形态学观察 37℃、5%(体积分数)CO2培养箱，含10%(体积分数)胎牛血清的完全1640细胞培养基培养细胞。传代时，800r/min离心5min，收集细胞悬液。按1∶3或1∶4分入新的培养瓶中，再加入适量1640完全培养基。锥虫蓝染色法活细胞计数>95%后，于Nikon TMSF倒置显微镜下观察各白血病细胞在白藜芦醇作用前后的形态、结构及数量的变化。

　　1.3 苏木素伊红(HE)染色 0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25、50、100μmol/L白藜芦醇处理细胞12、24、48h后，涂片，HE染色观察白血病细胞的凋亡情况。

　　1.4 MTT比色法进行细胞增殖分析 将细胞以完全RPMI 1640培养基配成5000个/mL细胞悬液，按照文献[3]方法进行白血病细胞增殖分析，同时设小鼠成纤维细胞3T3作正常细胞对照。

　　1.5 流式细胞术分析细胞周期 各组细胞培养24h，换含0.5%(体积分数)血清的RPMI 1640培养基同步化12h[4]，调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加3mL含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，培养6h。PI染色后在FACSCalibur型流式细胞仪上测定。

　　1.6 磷脂酰丝氨酸外翻分析 调细胞浓度为1×105个/mL细胞悬液。实验组加含白藜芦醇的培养基，对照组加等体积培养基，5%(体积分数)CO2，37℃，分别培养12、24、48h。FITC标记的AnnexinV和PI染色后立即用激光共聚焦显微镜和FACScan流式细胞仪检测。

　　1.7 Western检测Bcl2蛋白的表达水平 提取细胞总蛋白，调蛋白质量浓度至2mg/L。SDSPAGE电泳，半干法转膜1.5-2h。加入Bcl2单抗(TBST 1∶200稀释)，HRP标记的二抗(TBST 1∶5000稀释)，ECL法检测，图片扫描并且定量分析。以βactin作内标参考。

　　1.8 SP法检测HuT78、Jurkat、L1210细胞pSTAT3的表达 实验步骤依据试剂盒说明。其中pSTAT3抗体为1∶100稀释，DAB显色、苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照以0.01mol/L PBS代替一抗。在排除非特异性染色的情况下，以胞膜或胞质出现棕黄色连续或灶性颗粒性状分布为阳性表达。按照胞质和胞膜有无棕黄色染色及染色程度分为：(-)无阳性或阳性细胞<10%；(+)阳性细胞10-40%；()40-70%；()阳性细胞>70%。

　　1.9 统计学处理 所有数据均用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，方差不齐组经数据转换后再行方差分析；两样本间比较以Bonferroni t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 白血病细胞HuT78、Jurkat、L1210的形态学改变 0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25、50、100μmol/L白藜芦醇分别作用HuT78、Jurkat、L1210细胞12、24、48h，细胞形态发生较大改变，呈一定的时间、剂量依赖性。药物处理后，可见细胞数量减少、部分胞体缩小、胞膜皱缩、胞间隙增大、胞质中出现大小不等的不规则空泡(图1)。

　　2.2 细胞凋亡情况 经HE染色后，光镜下观察其形态。对照组细胞体积较大，细胞呈圆形，透光性好，核大而明显，核仁清楚，胞浆少，核质比高。经白藜芦醇处理后，白血病细胞数量减少，细胞皱缩，核直径减小，核仁减少或消失，核染色质浓集呈紫蓝色致密的球状或呈圆形分布于核膜下，胞浆皱缩、嗜碱性增加(图2)。

　　2.3 白藜芦醇对白血病细胞的生长抑制作用 白藜芦醇作用不同时间后，3种白血病细胞HuT78、Jurkat和L1210均受到不同程度的生长抑制，且呈一定的时间－剂量依赖性(图3A-图3C)。同等条件下，白藜芦醇对L1210细胞的抑制作用最强，生长抑制率最高可达66.17%；对HuT78及Jurkat细胞的生长抑制率最高分别为62.24%、45.98%。虽然白藜芦醇对这3种白血病细胞具有明显的抑制作用，但是并不影响正常细胞的生长(图3D)。经统计分析，各白血病细胞与正常3T3细胞相比均有显著性差异(P<0.01)。白血病细胞株之间相比，L1210与HuT78无显著性差异，L1210与Jurkat除了作用12h时差异显著(P<0.05)外，余者区别并不明显；而Jurkat与HuT78细胞相比，白藜芦醇作用48h时差异非常明显(P<0.01)。

　　图1 100μmol/L白藜芦醇处理24h时各组细胞的形态学变化（略）

　　Fig.1 Morphological changes of cells treated with 100μmol/L resveratrol for 24h (×400)

　　A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells

　　图2 100μmol/L白藜芦醇处理24h后各组白血病细胞的凋亡情况（略）

　　Fig.2 The apoptosis of tumor cells treated with 100μmol/L resveratrol for 24h (HE ×400)

　　A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells

　　图3 MTT法分析白藜芦醇对白血病细胞的生长抑制作用（略）

　　Fig.3 Inhibition of growth of resveratrol determined by MTT assay

　　A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells; D: mouse fibroblast 3T3 cells

　　2.4 白血病细胞周期的分布 流式细胞分析显示，白藜芦醇处理组较对照组G0/G1期细胞由34.93%减至30.12%，S期细胞由41.14%上升至49.17%(HuT78)；Jurkat细胞各周期未见显著变化；L1210细胞主要为S期改变：由59.02 %上升至65.57%，细胞被明显阻滞在S期(图4)。

　　图4 PI染色观察白藜芦醇对细胞周期分布的影响(培养6h)（略）

　　Fig.4 Resveratroinduced cell cycle perturbations and apoptosis in HuT78， Jurkat and L1210 cells cultured for 6h. Cells stained with PI

　　A， C， E: control cells incubated without resveratrol; B， D， F: HuT 78， Jurkat and L1210 cells treated with 50μmol/L resveratrol， respectively

　　2.5 白藜芦醇对白血病细胞凋亡的影响 激光共聚焦显微镜观察到50mol/L处理12h后，约25%L1210细胞发生早期凋亡，培养48h后，几乎所有的细胞都发生了凋亡或坏死(图5)。流式细胞术分析可见(图6)，100mol/L白藜芦醇作用12h，大多数HuT78细胞都发生了细胞凋亡(84.33%)；Jurkat细胞和L1210细胞的凋亡率分别为41.99%和50.94%。因此，同样条件下，白藜芦醇对HuT78细胞与L1210细胞的促凋亡作用强于对Jurkat细胞。

　　2.6 Bcl2蛋白的表达水平 本研究通过蛋白印迹法分析了不同浓度白藜芦醇对3种白血病细胞抗凋亡蛋白Bcl2的表达情况。与对照相比，白藜芦醇能明显降低HuT78、Jurkat与L1210细胞Bcl2蛋白的表达水平，且呈剂量依赖性(图7)。

　　图5 激光共聚焦显微镜观察50μmol/L白藜芦醇处理L1210细胞的形态变化（略）

　　Fig.5 The morphology of apoptotic cells treated with 50μmol/L resveratrol (×20)

　　A: 12h; B: 48h

　　图6 流式细胞术分析100μmol/L白藜芦醇处理12h时的细胞凋亡情况（略）

　　Fig.6 The apoptotsis of different cells treated with 100μmol/L resveratrol for 12h by flow cytometric analysis

　　A: HuT78 cells; B: Jurkat cells; C: L1210 cells

　　2.7 HuT78、Jurkat、L1210中pSTAT3蛋白的表达

　　pSTAT3在白血病细胞中表现为细胞质或细胞核呈棕黄色或含棕黄色颗粒，阳性表达>70%。细胞经白藜芦醇处理后免疫细胞化学结果显示，pSTAT3的表达水平显著下降(P<0.05，图8)。

　　图7 不同剂量白藜芦醇处理48h后，HuT78、Jurkat和L1210细胞Bcl2蛋白的表达情况（略）

　　Fig.7 The relative expression level of Bcl2 in HuT78， Jurkat and L1210 cells treated with different doses of resveratrol for 48h

　　图8 白藜芦醇对HuT78、Jurkat和L1210细胞中pSTAT3表达的影响（略）

　　Fig.8 The expression of pSTAT3 in HuT78， Jurkat and L1210 cells

　　A: pSTAT3 in HuT78; B: pSTAT3 in HuT78 treated with 100μmol/L resveratrol for 24h; C: pSTAT3 in Jurkat; D: pSTAT3 in Jurkat treated with 100μmol/L resveratrol for 24h; E: pSTAT3 in L1210; F: pSTAT3 in L1210 treated with 100μmol/L resveratrol for 24h

　　3 讨论
　　
　　本研究通过体外细胞培养，观察了不同浓度白藜芦醇对L1210、HuT78、Jurkat细胞的效应。白藜芦醇处理后，各组细胞都出现不同程度的形态学改变与细胞凋亡。比较3种白血病细胞可见，白藜芦醇对L1210 与HuT78细胞的生长抑制作用与促凋亡效应强于对Jurkat细胞。而且白藜芦醇在发挥对白血病细胞毒作用的同时，并不影响正常细胞的生长。鉴于抗肿瘤化疗药物往往都对正常细胞造成非特异性杀伤[5]，而从中草药或天然植物中提取的白藜芦醇不但具有良好的抗肿瘤效应，而且对正常细胞无明显的细胞毒作用。因此，对免疫缺乏人群具有更为重要的应用价值[6]。
　　
　　在这些工作的基础上，本研究继续深入探讨引起3种白血病细胞凋亡可能的作用机制。Western Blot实验结果显示，HuT78、Jurkat与L1210细胞中均有抗凋亡蛋白Bcl2的高水平表达。体外研究显示，Bcl2表达增加可见于滤泡型淋巴瘤、白血病等血液系统恶性肿瘤，明显延长白血病细胞的生存时间。Bcl2通过广泛抑制各种刺激剂诱导的细胞凋亡、延长细胞活力而发挥生物学作用。此外，Bcl2家族还与白血病的多药耐药有关。高表达的Bcl2能使白血病细胞抵抗一些化疗药物所诱导的细胞凋亡，导致白血病细胞对化疗药物不敏感、预后差[78]。本研究结果提示，下调Bcl2蛋白表达可能是白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的机制之一。
　　
　　越来越多的研究发现，相当一部分血液系统疾病的发生与造血调控异常有关。白血病是发生于造血干细胞的恶性克隆性疾病，JAK/STAT(signal transducers and activators of transcription，信号转导子和转录激活子)通路的持续激活与白血病细胞的增殖异常、凋亡受阻及分化障碍密切相关[910]。STAT家族是一组DNA结合蛋白，与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，发挥转录调控作用，介导多种生物学效应，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。研究证实，激活的STAT3信号能够将酪氨酸激酶信号进行整合，通过与DNA作用元件结合，激活与生长增殖有关的基因转录或者增加抗凋亡蛋白(如Bcl2)的表达，从而影响细胞存活和生长增殖，最终引起癌变。本研究发现，3种白血病细胞中均有较明显的STAT3酪氨酸磷酸化阳性表达，白藜芦醇能剂量依赖的减弱细胞中pSTAT3的表达。提示它能通过下调STAT3的酪氨酸磷酸化活性，使其下游靶基因蛋白Bcl2表达受阻，从而抑制白血病细胞的生长增殖、促进细胞凋亡。
　　
　　许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞周期阻滞，提示细胞周期阻滞在肿瘤细胞凋亡中能够发挥一定的作用。为研究白藜芦醇对白血病细胞增殖抑制作用的具体机制，本研究进一步观察了白藜芦醇处理后各组白血病细胞周期分布的变化。白藜芦醇对各组白血病细胞周期的影响与其增殖抑制效应密切相关。HuT78、L1210细胞出现明显的S期阻滞，Jurkat细胞的各周期未见显著性变化。实验结果可能与白藜芦醇对核苷酸还原酶和DNA聚合酶的抑制作用有关，因为这两种酶都是DNA合成过程中的关键酶，对于细胞通过S期至关重要[11]。白藜芦醇能通过干扰DNA复制，发挥对白血病细胞的增殖抑制作用。至于为什么3种白血病细胞接受同样作用后却产生了不同的结果，可能由于白藜芦醇对细胞周期的多个环节均有作用[12]，在不同细胞系，白藜芦醇发挥作用的具体途径可能并不一样。目前，对于白藜芦醇究竟如何影响细胞周期，各国科学家尚未达成共识。因此，有必要进一步深入研究，揭示白藜芦醇抗肿瘤作用的确切分子机制。
　　
　　目前，关于白藜芦醇诱导细胞凋亡的报道有一些相互矛盾的结论。有研究表明，白藜芦醇的促凋亡作用可能涉及p53依赖/p53非依赖途径、线粒体途径、NFκB信号通路等多种机制[1314]。但是，与促凋亡作用相反。也有学者发现，白藜芦醇能明显抑制受放射线照射小鼠的脾细胞凋亡，提高脾脏凋亡抑制基因Bcl2的表达水平，阻止细胞凋亡的发生[1516]。造成这些相互矛盾结果的原因可能是细胞内对白藜芦醇发挥作用的受体具有不同水平，或者白藜芦醇在不同的细胞中具有不同的新陈代谢，以及不同的检测体系导致不同细胞对同一凋亡诱导剂的反应能力有所不同。细胞信号转导网络的交互性或许可以解释白藜芦醇诱导凋亡作用与抑制凋亡作用的矛盾。

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