体外大鼠成骨细胞对破骨细胞形成的影响

【摘要】 目的 通过将鼠成骨细胞与破骨细胞直接共培养的实验方法，研究成骨细胞对破骨细胞分化及功能成熟的影响。方法 按照MCSF 30μg/L、RANKL 50μg/L的浓度对鼠骨髓单个核细胞诱导培养6d，与原代培养3d的鼠成骨细胞按细胞数量1∶1直接共培养，加入1，25(OH)2D3 1×10-8mol/L和PGE2 1×10-6mol/L，利用形态学观察、TRAP染色、骨吸收陷窝检测等方法对共培养细胞进行鉴定。结果 成骨细胞与破骨细胞共培养时，成骨细胞有明显的生长优势；染色后显微镜下可见大量呈单层排列的成骨细胞，偶见TRAP(+)的破骨细胞。结论 成骨细胞对破骨细胞分化及功能成熟的影响与两者的相对数量有关。本实验中，由于成骨细胞快速生长，当其数量多于破骨细胞时，可能使1，25(OH)2D3对成骨细胞RANKL表达的上调作用不足，且PGE2对成骨细胞OPG表达的下调作用不足，从而主要表现为对破骨细胞形成及分化的抑制作用。

【关键词】 破骨细胞 成骨细胞 细胞培养 RANKL MCSF

　　ABSTRACT: Objective By culturing the osteoclasts together with the osteoblasts directly to investigate the effect of osteoblasts on the formation of mature osteoclasts. Methods The bone marrow mononuclear cells of rats were treated with 30μg/L MCSF and 50μg/L RANKL and cultured for 6 days. Subsequently， the primary osteoblasts which were of the same quantity as the osteoclasts were cocultured directly. In the coculture system， we added the liquid containing 1，25(OH)2D3 1×10-8mol/L and PGE2 1×10-6mol/L. The morphological observation， TRAP staining and pit staining were adopted to identify osteoclasts. Results When the osteoclasts were cocultured with primary osteoblasts， the growth of osteoblasts had more preponderances. After staining， we could see more osteoblasts than osteoclasts. Conclusion The relationship between osteoblasts and osteoclasts is related to the relative quantities of the two cells. When osteoblasts outnumber osteoclasts， osteoblasts would inhibit the formation and differentiation of osteoclasts.

　　KEY WORDS: osteoclast; osteoblast; cell culture; RANKL; MCSF

　　正畸牙齿移动是伴随着牙槽骨的吸收和形成过程而发生的，牙槽骨的吸收是牙齿移动的第一步，成熟的破骨细胞(osteoclasts， OC)则是唯一能行使骨吸收功能的细胞[1]。当牙槽骨受到应力或其他刺激因素时，骨组织内发出一定信号，通过骨的微管腔隙传至骨表面的上皮细胞，上皮细胞再将这些信号传达出去，引导外周血中OC的祖细胞向患处定向游动、聚集，大量聚集于此处的破骨细胞前体细胞(preosteoclasts， pOC)与此处的成骨细胞(osteoblasts， OB)接触后开始分化为成熟的OC，并激活该细胞行使骨吸收的功能[24]。OB与OC之间的这种相互作用是与二者的相对数量有关的。因此，本实验拟通过建立OB和OC的直接共培养模型，观察OB对OC分化及功能成熟的调节作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂 4周龄SD雄性大鼠2只和出生1-2d的SD大鼠2只均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。主要试剂：αMEM培养基由美国GIBCO公司提供；胎牛血清由灏洋生物有限公司提供；细胞分离液Histopaque1083、巨噬细胞集落刺激因子MCSF、破骨细胞分化因子ODF/RANKL、萘酚ASBI磷酸盐、N，N二甲基酰胺均由美国Sigma公司提供。

　　1.2 玻片及牙本质片的制备 将4mm×4mm盖玻片经超声清洗后浸入硫酸重铬酸钾溶液中过夜，充分水洗烤干，高压灭菌后备用。取因正畸矫治需要拔除的健康牙，去除冠部釉质，冷冻后制备4mm×4mm、厚100-200μm的牙本质片，蒸馏水中超声清洗10min×3次，置于75%(体积分数)乙醇中，4℃保存备用，使用前在超净台中紫外灯照射消毒。

　　1.3 OC的培养 按照常规方法分离出鼠骨髓基质细胞，用αMEM全培养液[含15%(体积分数)胎牛血清、青霉素100u/mL、链霉素100μg/mL]重悬，加入MCSF(10μg/L)，分置于两个25cm2培养瓶中，37℃、5%(体积分数)CO2培养箱内培养24h。24h后，收集细胞悬液，离心，PBS清洗，Histopaque分离液分离单个核细胞，再用αMEM全培养液制备细胞悬液(2×106个细胞/mL)。在两个预置盖玻片的96孔培养板内加入细胞悬液后，每孔中再加入含MCSF 30μg/L，RANKL 50μg/L的培养液50μL，37℃、5%(体积分数)CO2培养箱内培养备用，每3d换液一次。

　　1.4 OB的原代培养[5] 在OC培养的第3天，取出生后1-2d的SD大鼠2只，拉颈处死后在75%(体积分数)的乙醇溶液中浸泡3-5min。无菌条件下，取颅盖骨(扁骨)，放入DHanks液中。去除骨膜及周围结缔组织，将其置于盛有αMEM全培养液的培养皿中，剪碎成0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的骨块，将骨块直接接种于培养瓶内，翻转培养瓶，使种植有骨块的一面朝上，加入3mL的αMEM全培养液，置入37℃、5%(体积分数)CO2培养箱内培养2h，再补加2mL αMEM全培养液，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养瓶中，37℃、5%(体积分数)CO2培养箱内培养3d备用。

　　1.5 OC与OB共培养[6] 分别用2.5g/L(0.25%)胰酶(pH 7.2)、0.2g/L(0.02%)乙二胺四乙酸(EDTA)消化培养6d的OC和培养3d的OB，制备细胞悬液，将1×107个/mL的OC和1×107个/mL的OB分注于Ⅰ型胶原预先铺底的6孔培养板中，加入1×10-8mol/L 1，25(OH)2D3和1×10-6mol/L PGE2，充分混匀，其中2孔预置牙本质片及盖玻片，37℃、5%(体积分数)CO2培养箱内培养6d，每3d换液一次。

　　1.6 倒置显微镜观察 应用相差倒置显微镜观察培养细胞的形态与运动状况。

　　1.7 TRAP染色 取共培养6d后的细胞爬片，经2.5%(体积分数)戊二醛4℃固定20min，蒸馏水冲洗3次，放入新配置的TRAP染色孵育液内，37℃孵育50min，蒸馏水冲洗3次，甘油明胶封片，光镜观察。

　　1.8 骨陷窝检测 取共培养6d后的牙本质片，2.5%(体积分数)戊二醛固定液固定7min，于0.25mol/L氢氧化铵中超声清洗1min×3次，系列酒精脱水，自然晾干，1%(体积分数)甲苯胺蓝室温染色4min，蒸馏水清洗后光镜下观察。

　　2 结果

　　2.1 OC的形态学观察 在细胞培养的第1天，显微镜下为贴壁生长的单个核细胞，形态圆形或椭圆形；从培养第2天开始，贴壁细胞逐渐伸展，部分细胞体积开始变大；至培养第4天时，可观察到单个核细胞开始融合的现象；培养第6天时，可见大量多核的OC，圆形或不规则形，胞体大，折光性强，有的细胞出现细长伪足，核的数目3-15个不等(图1)。

　　图1 培养的破骨细胞在倒置显微镜下的观察结果（略）

　　Fig.1 Observation of phase contrast microscope for OC (×200)

　　A: OC cultured for 1 day; B: OC cultured for 2 days; C: OC cultured for 4 days; D: OC cultured for 6 days

　　2.2 OB及共培养体系的形态学观察 组织块在培养24h后，即可见少量短梭形、三角形细胞从骨块边缘长出，随时间的延长，细胞数量逐渐增多，相邻骨块长出的细胞开始汇合(图2A、图2B)。共培养体系中，OB较OC有明显的生长优势，倒置显微镜下，OB 3d左右就形成单层覆盖；培养至第5天，两种细胞分层明显，可见呈“油煎蛋样”的OC位于OB之上，且数量明显少于OB(图2C、图2D)。

　　图2 共培养体系在倒置显微镜下的观察结果（略）

　　Fig.2 Observation of phase contrast microscope for cocultured system

　　A: OB cultured for 1 day (×100); B: OB cultured for 3 days (×200); C: cocultured for 3 days (×200); D: cocultured for 6 days (×200)

　　2.3 TRAP染色及骨吸收陷窝的观察结果 显微镜下见大量染为淡黄色的OB，而胞质染为酒红色，胞核为淡黄色的OC数量较少，且多分布在OB之间(图3A、图3B、图3C)。共培养6d后的骨片，经甲苯胺蓝染色后未观察到典型的骨吸收陷窝(图3D)。

　　图3 培养的破骨细胞TRAP染色及骨吸收陷窝的检测结果（略）

　　Fig.3 Results of TRAP staining and absorption pit for OC

　　A: TRAP staining for cocultured 3 days (×200); B: TRAP staining for cocultured 6 days; C: TRAP (+) multinucleate OC (×400); D: result of absorption pit (×200)

　　3 讨论
　　
　　OC是一种组织特异性的多核巨噬细胞，是由单核巨噬细胞的前体细胞分化而来的。1981年Rodan等提出了OB可能参与OC分化的假设。Takahashi等[7]于1988年首先在体外诱导OC分化取得成功，即小鼠的骨髓细胞或脾细胞与基质细胞共培养后产生OC。他们认为基质细胞与骨髓细胞的密切接触是OC形成的必要条件。
　　
　　OB在骨吸收刺激因子作用下，需要通过特定的信号转导通路将骨吸收信号传递给OC，以调节OC的生成及其功能。目前，认为骨髓来源的成骨/基质细胞主要通过两种方式参与调节pOC的增殖、分化，一是通过细胞细胞方式的直接接触，一是通过产生可溶性因子的间接接触。Suta等[8]通过骨髓基质细胞的培养证实，OB具有调节OC分化的特性。但是，如果在这个共同培养体系中用一层半透膜将脾细胞或骨髓细胞，即pOC与成骨/基质细胞分隔开时，即使加入诱导因子如1，25(OH)2D3、IL6、IL11等，均不可生成成熟的OC。由此说明，细胞细胞方式的直接接触调节中，成骨/基质细胞与pOC的直接接触，是OC形成、分化过程中必不可少的因素之一。因此，本实验选择细胞细胞直接接触的方式，以研究OB对OC分化、成熟及其活性的影响。
　　
　　1，25(OH)2D3作为OC成熟的主要激活因子，具有明显促进骨吸收的作用，其信号转导方式为维生素D3受体转导途径[9]，但其特异性受体只存在于OB及前OB的细胞膜上，OC膜上并无其受体。因此，它对体外分离培养的OC并无作用，只有在OB存在时，才能刺激OC性骨吸收的形成。目前，大多数学者认为1，25(OH)2D3对颅盖骨OB RANKL表达有上调作用[9]。
　　
　　
　　PGE2对骨髓基质细胞(hBMSC)有下调作用，1mol/L的PGE2对OPG mRNA即有明显的下降作用。Northern杂交发现PGE2促进悬浮生长及贴壁生长的hBMSC RANKL mRNA的表达。此外，PGE2对颅盖骨OB OPG mRNA表达有下调作用，而对RANKL mRNA的表达有上调作用，从而刺激OC的分化与激活[10]。因此，本实验选择了1，25(OH)2D3和PGE2作为共培养模型中的诱导因子。
　　
　　激活核因子NFкB受体的配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand， RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin， OPG)和NFкB受体活化因子(receptor activaror of NFкB， RANK)形成一个调节系统，影响OC的生成。当胞外刺激因素作用于成骨/基质细胞，诱导其膜上表达RANKL分子，通过与pOC膜上的RANK直接结合，而后pOC内的肿瘤坏死因子受体关联因子(TNFRassociated factors， TRAF)与RANK的胞内区结合，将信号传入前体细胞，引起级联瀑布反应，使OC分化成熟。而OPG则由成骨/基质细胞旁分泌发挥作用，竞争性与RANKL结合，封闭RANKL与RANK的结合，抑制OC的分化、成熟[11]。
　　
　　Lee等[12]首先将MCSF和RANKL作为诱导因子，使小鼠骨髓中分离的单个核细胞分化为OC，在1×10-8mol/L 1，25(OH)2D3和1×10-6mol/L PGE2诱导下再与OB共培养，利用OC对Ⅰ型胶原的特殊黏附作用进行纯化，获得了大量成熟的OC。本实验中，共培养体系中OC的数量急剧减少，可能与OB(1×107个/mL)与OC(1×107个/mL)数量比有关。由于OC不能增殖和传代而OB是不断增殖的，所以共培养体系中OB的数量在培养过程中增加较快，相同剂量的1，25(OH)2D3对颅盖骨OB RANKL表达上调作用不足；PGE2通过蛋白激酶A途径抑制OPG mRNA表达作用不足，而OPG通过OB旁分泌作用，与RANKL的相对比例增加，竞争性与RANKL结合，封闭RANKL与RANK的结合，使信号无法传入，从而抑制了OC的分化和成熟。
　　
　　本实验选择细胞细胞直接接触的方式，将鼠OB与OC共培养，发现将OC与OB按照1∶1共培养时，OB的数量增长较快，诱导因子1，25(OH)2D3对OB细胞表面RANKL mRNA表达的上调作用不足；PGE2对OB细胞表面OPG mRNA表达的下调作用不足，从而主要表现为对OC分化及功能成熟的抑制作用。然而，对于OB是如何抑制OC分化的生物学机制仍需要进一步的研究。

参考文献

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