羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤PS2、COX2的影响

【摘要】 目的 探讨羟基喜树碱对人胆管癌QBC939裸鼠移植瘤的乳癌相关肽(PS2)、环氧合酶2(COX2)的影响，分析PS2、COX2与肿瘤发生、发展的关系。方法 建立人胆管癌QBC939细胞株裸鼠皮下移植瘤模型，将30只裸鼠随机分成对照组、羟基喜树碱低剂量组和羟基喜树碱高剂量组，观察移植瘤体生长情况，RTPCR法检测瘤体内PS2、COX2mRNA表达。结果 与对照组比，羟基喜树碱低、高剂量组都可使移植瘤体的PS2 mRNA表达增高；COX2 mRNA表达降低，且瘤体生长减慢，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 羟基喜树碱可降低移植瘤COX2mRNA表达，增高移植瘤体的PS2 mRNA表达，并使人胆管癌裸鼠移植瘤生长减慢。

【关键词】 胆管癌 裸鼠 移植 QBC939细胞 PS2；COX2

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of hydroxycam ptothecine on PS2 and COX2 in nude mice by human bile duct carcinoma QBC939 cells in order to analyze the correlation between PS2 and COX2 expressions and the development of the tumor. Methods After the model of the transplanted tumor of subcutaneous tissues located the nude mice was constructed by human bile duct carcinoma QBC939 cells， 30 nude mice were randomly pided into 3 groups， namely， control group， hydroxycamptothecine lowdose group and highdose group. The growth of the transplanted tumor was observed and immunohistochemical staining combined with image analysis was used to determine the expression of PS2 and COX2 in the tumor tissues. Results Compared with that of the control group， the content of PS2 in the tumor tissues was increased in hydroxycamptothecine lowdose group and highdose group. The content of COX2 was decreased and the growth of the transplanted tumor was inhibited in both hydroxycamptothecine lowdose group and highdose group (P<0.01). Conclusion Hydroxycamptothecine can reduce the contents of COX2 and increase the contents of PS2 in the transplanted tumor tissues， thus inhibiting the tumor growth.

　　KEY WORDS: bile duct carcinoma; nude mouse; transplantation; QBC939 cell; PS2; COX2

　　肿瘤的增殖、侵袭和转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程，本实验通过观察羟基喜树碱对人胆管癌细胞株裸鼠皮下移植瘤乳癌相关肽(PS2)、环氧合酶2(COX2)和瘤体生长的影响，为临床肿瘤的药物治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 BALB/c(nu/nu)裸鼠(购自上海市肿瘤研究所中科院上海实验动物中心)，共26只，雄性，4-6周龄，体重(18±2)g，在无特殊病原体(specificpathogen free， SPF)条件下饲养。

　　1.2 药物及试剂 羟基喜树碱(hydroxycam ptothecine， HCPT，湖北黄石飞云制药公司，批号：H4202283)；PS2、COX2抗体(美国Santa Cruz公司)，RTPCR相关试剂(晶美有限公司)，Trizol试剂(美国GIBCO BRL公司)。

　　1.3 胆管癌QBC939细胞株的培养、制备 胆管癌QBC939 细胞株用DMEM+100mL/L小牛血清培养至第三代生长密集时，用2.5g/L胰蛋白酶+2g/L EDTA消化、洗涤、离心后，配制成接种细胞浓度5×106/mL。

　　1.4 荷瘤裸鼠动物模型的建立[1] 选用1.3中制备的人胆管癌QBC939细胞株直接注射接种于2只裸鼠颈侧和大腿皮下，共4处，每处0.2mL，成瘤后取出肿瘤组织，取样器切成约1mm×1mm×1mm组织块，用6号套管针在左侧腋部皮下移植实体瘤模型。待瘤体直径约0.3-0.5cm时，分别标记，并随机分成3组，每组10只，共30只裸鼠。

　　1.5 实验分组 对照组：腹腔内注射生理盐水10mL/kg；羟基喜树碱低剂量组：腹腔内注射羟基喜树碱2.5mg/kg；羟基喜树碱高剂量组：腹腔内注射羟基喜树碱10mg/kg，各组均每周腹腔注射1次，连续3周(药物剂量参照人体体重剂量的10倍左右给予)，实验共3周。每周观察瘤体的生长情况，并测量瘤体的长径和短径，实验期间按以下公式计算瘤体体积(V/mm3)：V=(a×b2)×π/6[1]。

　　1.6 RTPCR检测PS2、COX2 mRNA表达 取10μg瘤体组织采用Trizol试剂提取各组标本的总RNA，以THERMOSCRIPTTM RTPCR系统(GIBCOBRL) 进行逆转录和PCR反应。取1μL逆转录产物进行PCR扩增，PS2正义引物序列为：5′CCATGGAGCACAAGGTGACCTG3′，反义序列为：5′AAGCCACAATTTATTCT3′，COX2正义引物序列为：5′ACACTCTATCACTGGCATCC3′，反义序列为；5′GAAGGGACACCCTTTCACAT3′退火温度为52℃，扩增长度分别为124bp、230bp，选用内对照β1肌动蛋白，扩增引物为：正义：5′TGGGACGATATGGAGAAGAT3'，反义：5′ATTGCCGATAGTGATGACCT3′。退火温度为52℃，扩增长度分别为321bp。在10g/L琼脂糖凝胶中电泳观察PCR产物并用计算机凝胶图像分析系统检测吸光度。

　　1.7 统计学处理 所有数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件处理，采用重复测量方差分析，检验标准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 裸鼠移植瘤生长情况 与对照组相比，羟基喜树碱低剂量组及高剂量组瘤体体积增长减慢，均有统计学意义(P<0.05，表1)。

　　表1 各组裸鼠移植瘤体积的比较（略）

　　Table 1 The volume of the transplanted tumor in the nude mice of each group

　　*P<0.05 vs. control

　　2.2 移植瘤组织内PS2、COX2 mRNA的表达 与对照组比较，低剂量组和高剂量组移植瘤体的PS2 mRNA表达增高，COX2 mRNA的表达降低，差异有统计学意义(P<0.01，表2，图1-图2)。

　　图1 PS2 mRNA RTPCR表达（略）

　　Fig.1 The expressions of PS2 mRNA by RTPCR

　　M: DNA marker; 1: control group; 2: lowdose group; 3: highdose group

　　图2 COX2 mRNA RTPCR表达（略）

　　Fig.2 The expressions of COX2 mRNA by RTPCR

　　M: DNA marker; 1: control group; 2: lowdose group; 3: highdose group

　　表2 各组裸鼠移植瘤内PS2、COX2 mRNA的吸光度（略）

　　Table 2 The PS2 and COX2 mRNA absorbance of the transplanted tumor in the nude mice of each group

　　*P<0.01 vs. control

　　3 讨论
　　
　　COX2是一种诱导酶，正常生理情况下在多数组织中不表达，但可被广泛的血管内外激活物如脂多糖、白介素1、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、转化生长因子α、血小板激活因子及各种促癌因素等诱导表达，故又被称为“早期即刻”基因[2]。研究表明COX2与胆管癌的发生、发展密切相关，靶向COX2治疗有可能成为胆管癌治疗的一个新靶点[36]。Wu等[5]对56例肝外胆管癌标本研究发现，COX2的表达与淋巴结转移、远处转移呈正相关，而与肿瘤分化呈负相关。这提示COX2有可能作为判断胆管癌预后的一个独立性指标。
　　
　　PS2属于三叶草因子家族，正常表达于胃组织，异位表达于胃肠道炎症和大量癌组织中。其表达受多种因素调节[7]。PS2在恶性组织中的广泛表达[8]，表明它在组织的恶变过程中发挥着一定作用，可能会成为癌的一个标记物[9]。
　　
　　本实验检测人胆管癌裸鼠移植瘤内PS2、COX2 mRNA的表达结果显示，与对照组比，羟基喜树碱低剂量组和高剂量组都可使移植瘤体的PS2 mRNA表达增高，COX2 mRNA表达降低，而且瘤体体积增长慢，差异有统计学意义(P<0.01)。此项实验研究结果为临床胆管癌患者的诊治提供理论基础，也为研究抗肿瘤药物作用机制提供实验依据。

参考文献

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　　[8]Martin V， Ribieras S， Rio MC. The estrogen responsive element of the PS2 gene is recognized by a methylation sensitive DNA binding protein [J]. Biol Chem， 1998， 379(45):409416.

　　[9]Gillesby BE， Stanostefano W， Porter W. Identification of amotif within the 5 regulatory region of PS2 which is responsible for AP1 binding and TCDDmediated suppression [J]. Biochemistry， 1997， 36:60806089.