快速老化小鼠的学习记忆缺陷及其生化机制

【摘要】 目的 用快速老化小鼠(SAMP8)模拟老年痴呆，观察其学习记忆能力，并探讨其学习记忆能力下降的可能机制。方法 采用10月龄SAMP8，并用同龄抗快速老化小鼠(SAMR1)作为正常对照。用水迷路检测近记忆以及空间学习记忆能力。用生物化学方法检测大脑皮层线粒体膜电位和ATP酶活力，观察线粒体功能；检测皮层和海马胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)的活力，观察中枢胆碱能神经功能；检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛 (MDA)含量，观察其全身性氧化应激状况。结果 与SAMR1相比，SAMP8出现明显的衰老体征，其近记忆和空间学习记忆能力明显减弱，具有衰老和痴呆特征；皮层线粒体膜电位和ATP酶活力显著降低，海马ChAT活力显著下降，AChE活力显著升高，血清SOD活力稍有增高。结论 SAMP8可以很好地模拟老年痴呆，其机制包括大脑皮层线粒体功能降低、海马胆碱能神经功能下降以及氧化应激等。

【关键词】 快速老化小鼠 老年痴呆 线粒体 胆碱能神经 氧化应激

　　ABSTRACT: Objective To simulate senile dementia with senescenceaccelerated mouse/prone 8 (SAMP8) and investigate its learning and memory deficits， and their biochemical mechanisms. Methods The general status of SAMP8 was investigated compared with that of SAM/resistance 1 (SAMR1). Then their recent memory and spatial learning and memory abilities were detected with water maze. The mitochondrial membrane potential and adenosine triphosphatase (ATPase) of cortex were determined with biochemical method to investigate their mitochondrial function. The choline acetyltransferase (ChAT) and acetylcholinesterase (AChE) activities of cortex and hippocampus were detected with the above method to observe their central cholinergic nerve function. The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in serum of mice were determined with biochemical method to observe their general oxidative stress. Results Compared with SAMR1， SAMP8 displayed significant senile physical signs， and weak recent memory and spatial learning and memory capabilities were similar to those characteristics of senescence and dementia. Meanwhile， the mitochondrial membrane potential and ATPase activity of cortex， and the ChAT activity of hippocampus were lower than those of SAMR1， but the AChE activity of hippocampus was higher than that of SAMR1， and the serum SOD activity was slightly higher than that of SAMR1. Conclusion SAMP8 may simulate senile dementia and its pathogenesis involves insufficient cortex mitochondrial function， decreased cholinergic nerve function， and oxidative stress.

　　KEY WORDS: senescenceaccelerated mouse/prone 8(SAMP8); senile dementia; mitochondrion; cholinergic nerve function; oxidative stress

　　快速老化小鼠(senescenceaccelerated mouse， SAM)是日本京都大学Takeda等人通过对AKR/J系小鼠进行筛选得到的品系，可分为两个亚系，即P系和R系。前者称为快速老化小鼠(SAM/prone， SAMP)，表现有脱毛、皮肤粗糙、行为障碍及生存期缩短等衰老现象，并有遗传倾向；后者称为抗快速老化小鼠(SAM/resistance， SAMR)，有正常的衰老过程[1]。SAM目前共有12个亚系，其中SAMP8主要以学习记忆功能呈增龄性衰退，中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主[23]。文献报道，SAMP8在增龄过程中脑内有大量β淀粉样肽(Aβ)沉积[4]，与学习记忆功能相关的脑内神经递质也发生相应改变，如大脑皮层和海马乙酰胆碱、去甲肾上腺素水平降低，阿片肽、γ氨基丁酸水平升高，5羟色胺先升高后降低等[56]。SAMP8脑内脂质过氧化物含量与同龄SAMR1相比也升高，氧化抗氧化系统紊乱，出现氧化应激损伤[4，7]，同时伴有明显的线粒体功能紊乱[8]。总之，SAMP8可以较好的模拟自然衰老过程中缓慢发生的老年痴呆，是研究衰老与学习记忆功能以及学习记忆功能障碍发生机制的良好动物模型。
　　
　　本研究用水迷路检测SAMP8的近记忆和空间学习记忆能力，用生化方法测定其脑组织及血清与学习记忆和衰老相关的生化指标，旨在明确衰老过程中，脑生化改变与智力衰退的相关性及可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 SAMP8和SAMR1各16只，10月龄，♂，清洁级，购自天津中医药大学第一附属医院，合格证：津实动质M准字第006号。

　　1.2 药品和试剂 胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase， ChAT)试剂盒，批号20070228；乙酰胆碱酯酶 (acetylcholinesterase， AChE)试剂盒，批号20070226；三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase， ATPase)试剂盒，批号20070228；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)试剂盒，批号20070226；丙二醛 (malondialdehyde， MDA)试剂盒，批号20070226；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，批号20061211。以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Rhodamine123为Sigma产品。

　　1.3 仪器 水迷路由中国医学科学院药物研究所研制；MQX200型酶标仪为美国Bio Tek Instruments产品。

　　1.4 方法

　　1.4.1 分组及设计 实验分两组：SAMP8组和SAMR1组。首先进行一般状态的观察，包括体征、体重，然后进行行为学实验，检测动物的空间学习及近记忆能力。行为学实验结束后，将动物麻醉，颈动脉取血制备血清，然后断头取脑，分离皮层和海马。将一侧皮层及两侧海马制备成100g/L的生理盐水组织匀浆，另一侧皮层用线粒体匀浆液制备成100g/L的匀浆，并提取线粒体。测定血清SOD活力和MDA含量，皮层和海马ChAT、AChE活力以及皮层线粒体膜电位和ATP酶活力。

　　1.4.2 水迷路实验 水迷路装置是一个双层不透明的方形塑料盒(80cm×50cm×20cm)，实验时盛水，其中有4个盲端和1个终点台阶，小鼠可沿此台阶爬出水面，起点则可以灵活设置。不同的起点含有的盲端数不同。通过测定小鼠在游泳过程中进入盲端的错误次数和到达终点所花费的时间，判断其近记忆和空间学习记忆能力。实验时，先将小鼠放在终点台阶上适应5s，然后将其从起点放入水中，记录进入盲端的错误次数和找到安全台阶花费的时间，即逃避潜伏期，总时间限定3min，如在3min内未找到台阶，则由实验人员将其引导至终点，潜伏期按3min计。训练及测试共5次，分别经由含2、3、4、4、4个盲端的路线进行。

　　1.4.3 线粒体的提取及其膜电位的测定 将小鼠一侧皮层按重量体积比1∶9加入预冷的线粒体匀浆液，剪碎组织，转入玻璃匀浆器，手动匀浆，4℃ 2000g离心3min，取上清；上清于4℃ 12500g离心8min，弃上清，取沉淀；沉淀用预冷的30g/L Ficoll液悬起，平铺于预冷的60g/L Ficoll液上，缓慢加速至11500g，离心30min，弃上清；以预冷的线粒体匀浆液洗沉淀后，再次悬于1mL预冷的匀浆液中，4℃ 11500g离心10min，沉淀即为线粒体，重新悬于少量预冷的线粒体匀浆液中。用考马斯亮兰法标定线粒体蛋白浓度，用匀浆液稀释，使其蛋白质量浓度在5mg/kg左右。
　　
　　新鲜制备线粒体，96孔板每孔加入192μL膜电位反应缓冲液和4μL Rhodamine123 (26μmol/L)，酶标仪上测定激发波长503nm、发射波长527nm条件下的基础荧光值；然后加入不同实验组的线粒体蛋白溶液4μL，混匀，立即开始计时，室温放置30s后，连续测定4min内荧光值的变化。以每孔加入线粒体前的荧光值为基础值，加入线粒体蛋白后的荧光强度以相应荧光值相对于基础值的变化量表示。

　　1.4.4 生化检测 从小鼠一侧颈总动脉取血，制备血清；然后将小鼠断头取脑，在冰浴上剥离出皮层和海马组织，用滤纸吸干后称重，按重量体积比1∶9加入4℃预冷的生理盐水，用内切式匀浆机制备10%的组织匀浆；低温低速离心10min，取上清弃沉淀，以备生化测定；用考马斯亮兰法标定蛋白。皮层和海马ChAT、AChE活力，皮层线粒体ATP酶活力以及血清SOD活力、MDA含量的测定均按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。

　　1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 快速老化小鼠的一般状态观察 一般状态的观察发现，与同龄SAMR1比较，多数10月龄SAMP8体型偏小，头颈部、背部有毛发竖立、凌乱和脱落现象，有些背后部甚至出现光秃，行动略显迟缓，活跃程度降低；SAMR1则体格较大，毛发整齐、有光泽，活跃，行动敏捷。SAMP8的平均体重(25.2±0.5)g，明显低于SAMR1的平均体重(28.4±0.7)g(P<0.01)。可见，与同龄SAMR1比较，SAMP8出现了衰老体征。

　　2.2 快速老化小鼠的学习记忆能力 水迷路实验常用于测试动物的近记忆和空间学习记忆能力。通过测定动物进入盲端的错误次数和找到台阶的潜伏期反映其学习记忆能力。本实验中，第一、二次采用的盲端总数分别为2和3个，第三到第五次则为4个。在前三次训练中，SAMP8和SAMR1进入盲端的错误次数没有显著差别；第三到五次测试中，两组动物进入盲端的错误次数均逐渐减少，表明动物对台阶位置的记忆逐渐增强，但在第四、五次测试中，前者的错误次数明显多于后者，经组间t检验，有统计学意义(P<0.01)。第一、二次训练中，SAMP8找到台阶的潜伏期明显长于后者(P<0.05，P<0.001)，以后，随着训练次数的增加，二者找到台阶的潜伏期均逐渐缩短，但SAMP8的潜伏期非常明显的长于后者(P<0.001)。事实上，在最后一次测试中，SAMP8组15只动物中仍有7只在3min内找不到台阶，而SAMR1组16只中仅有1只未能找到台阶(图1)。表明SAMP8的近记忆和空间学习记忆能力非常明显的弱于同龄SAMR1。

　　图1 水迷路实验快速老化小鼠进入盲端的错误次数和逃避潜伏期（略）

　　Fig.1 Comparisons of the numbers of entering nonexits and finding the steps of SAMP8 and SAMR1 in water maze

　　A: the number of SAMP8 entering nonexits was markedly more than that of SAMR1; B: the latency of SAMP8 finding the safe steps was significantly longer than that of SAMR1， indicating that its recent memory and spatial learning abilities were significantly lower than those of SAMR1. *P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001 vs. SAMR1 group (±s， n=15-16)

　　2.3 快速老化小鼠的组织生化检测结果

　　2.3.1 大脑皮层线粒体膜电位 线粒体膜电位反映线粒体膜的完整性。本实验以荧光强度的变化值表示大脑皮层线粒体对Rhodamine 123的摄取速率和摄取量，间接反映线粒体膜电位。从图2可以看出，加入线粒体后，SAMP8组的荧光强度降低值明显低于SAMR1组(P<0.05)，而且这种变化持续到4min(实验结束时间)。表明SAMP8的线粒体膜电位显著低于同龄SAMR1，说明前者的线粒体膜完整性不足。

　　2.3.2 大脑皮层线粒体产能功能 线粒体ATPase是反映线粒体产能功能的重要指标之一。本实验测定了大脑皮层线粒体ATPase活力，发现SAMP8的皮层ATPase活力明显低于SAMR1的皮层ATPase活力(P<0.01)。表明SAMP8的线粒体产能功能明显下降，脑组织内ATP可能显著减少(表1)。

　　2.3.3 脑组织ChAT和AChE活力 ChAT是脑内神经递质ACh的合成酶，AChE是ACh的水解酶。脑组织中二者的活力反映了ACh的合成和水解状况，进而反映了脑内胆碱能神经的功能，而胆碱能神经功能与学习记忆有密切关系。本实验测定了大脑皮层和海马组织中这两种酶的活力，发现皮层中两酶的活力在SAMP8和SAMR1之间没有差别，而在SAMP8的海马中ChAT的活力低于SAMR1海马中该酶活力(P<0.05)，SAMP8海马中AChE的活力则明显高于SAMR1海马中该酶的活力，有统计学差异(P<0.01)。以上说明，与SAMR1比较，SAMP8海马中ACh合成能力下降，而水解能力增强，从而导致其海马中ACh含量下降，胆碱能神经功能降低(表1)。

　　图2 SAMP8和SAMR1大脑皮层线粒体膜电位的比较（略）

　　Fig.2 Comparison of the mitochondrial membrane potential in cortex from SAMP8 and SAMR1. Fluorescent intensity was used in showing mitochondrial membrane potential indirectly. The diminished value of the fluorescent intensity of SAMP8 was significantly smaller than that of SAMR1， indicating that the mitochondrial membrane potential of SAMP8 was markedly lower than that of SAMR1

　　*P<0.05 vs. SAMR1 group (±s， n=11)

　　2.3.4 血清SOD活力及MDA含量 SOD是血清中重要的抗氧化酶，MDA是组织细胞脂质过氧化的产物之一。实验中发现，SAMP8血清中SOD的活力[(312±19)u/mL]略高于SAMR1血清中该酶活力[(290±17)u/mL]，并有统计学差异(P<0.01)，但考虑到高出幅度不足8%，故认为SAMP8血清抗氧化能力不低于同龄SAMR1。SAMP8血清中MDA含量[(24.7±5.0)nmol/mL]仅有高于SAMR1血清中该氧化产物含量[(22.8±3.2)nmol/mL]的趋势，没有统计学差异。

　　表1 SAMP8和SAMR1脑组织生化指标的比较（略）

　　Table 1 Comparisons of the biochemical indexes in brains from SAMP8 and SAMR1

　　ATPase: adenosine triphosphatase; ChAT: choline acetyltransferase; AChE: acetylcholinesterase; prot: protein

　　*P<0.05， **P<0.01 vs. SAMR1 group (±s， n=10-12)

　　3 讨论
　　
　　研究老年痴呆(AD)常使用多种动物模型，如D半乳糖模型、Aβ模型、叠氮钠模型等。这些模型尽管表现出部分特征性病理改变，但并不能完全模拟人类疾病渐进性的退行性改变。使用转基因动物研究AD是目前的热点，但无论单转、双转或三转基因小鼠，都仅仅考虑了个别因素在AD发病过程中的作用和机制。我们知道，AD是一个多病因疾病，涉及氧化应激损伤、胆碱能神经功能异常、兴奋性氨基酸毒性、遗传等多种机制。SAMP8既可出现学习记忆障碍，又有部分AD病理学特征，并且它是一种快速自然发病模型，伴快速老化，其脑的形态、结构和功能全面退变，与人衰老和痴呆的临床特征比较接近，是目前较为理想的AD替代模型[911]。
　　
　　水迷路实验是测定动物近记忆和空间学习记忆能力的经典实验。研究发现，SAMP8的近记忆和空间学习记忆能力均明显弱于SAMR1。这些症状非常类似AD的主要症状。同时，从一般状态来看，SAMP8出现明显的衰老体征。因此，本研究所用SAMP8可以较好地模拟AD。
　　
　　Rhodamine123是一种亲脂性荧光染料，可对活细胞进行荧光染色，其荧光信号主要集中于线粒体，一定的膜电位形成一定的荧光值，因此荧光值的高低反映了线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位崩溃是细胞凋亡的重要事件之一，也是细胞凋亡的早期变化。已有研究表明，细胞凋亡加速会导致AD等慢性退行性病变的发生[12]。AD患者脑组织氧化和能量代谢受损，线粒体电子传递链中一个或多个酶活性的丧失或是ATP合酶活力的下降均可使脑能量储备减少，能量代谢(ATP产生)的异常(由于低氧或编码线粒体电子链的蛋白酶类的基因突变)可诱导神经元发生凋亡或增加其对凋亡的敏感性[1314]。本研究发现，SAMP8大脑皮层线粒体膜电位和总ATP酶活力明显低于SAMR1，表明其线粒体功能严重不足，由此可能加速细胞凋亡，进而参与AD的发生。
　　
　　众所周知，哺乳动物脑内基底前脑胆碱能神经元、海马和皮层及它们之间的通路是学习记忆功能的重要结构基础。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前ACh的合成、ChAT的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降。这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关[1516]。我们研究发现，SAMP8海马ChAT活力明显下降，而AChE活力显著增高，这说明海马胆碱能神经递质ACh合成减少、水解加速，其含量必然下降，神经传递功能也会显著下降，其学习记忆功能必然降低。此发现与既往文献报道一致[5，1718]。
　　
　　实验室和AD患者积累的研究数据显示，氧化应激在AD的发病以及衰老的发生发展中起重要作用。活性氧分子(reactive oxygen species， ROS)的生成很早发生，甚至早于AD的分子改变(老年斑和神经纤维缠节)和症状的发生。ROS可以导致细胞主要成分，如脂质、蛋白质和核酸损伤，引起细胞凋亡或坏死。AD的自由基假说认为增加的脂质过氧化物引起大量细胞内酶活性的改变，最终加速神经退行性病变的进程[1920]。血清中的氧化水平反映了整个机体的氧化水平，正常的氧化与抗氧化水平使机体自由基的产生和清除达到动态平衡，最大限度地减少自由基对机体组织细胞的损害。SOD是血清主要抗氧化酶之一， MDA是组织细胞脂质过氧化的一个产物。研究中发现，SAMP8血清的SOD活力和MDA含量类似或略高于SAMR1，推测体内氧自由基的产生和MDA水平在两种动物之间并无明显差别。此发现与文献报道不完全一致，两种动物的氧化水平、自由基产生以及清除能力有待进一步研究。
　　
　　当前，随着人口老龄化的发展，AD的发病率日益增高。寻找和开发具有防治AD作用的药物迫在眉睫。如上所述，SAMP8可以很好的模拟早老性痴呆，用于研究其病理特征和发病机制。通过研究，我们发现，SAMP8学习记忆能力下降的可能机制包括脑组织线粒体功能的异常下降和海马胆碱能神经功能的降低。此模型可用于开发具有脑保护作用的抗痴呆药物。

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