氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 研究氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响。方法 将32只兔子随机分组，正常组未采取任何处理，氨基胍组及模型组行右后肢伸直位管型石膏固定造模， 氨基胍组腹腔内注射100mg/(kg·d)氨基胍硫酸盐溶液，模型组每天腹腔内注射相同体积的生理盐水。分别于4周和8周处死动物，留取标本观察软骨大体形态，切片HE染色观察镜下形态，免疫组化检测iNOS表达，TUNEL法原位检测凋亡。结果 与模型组相比，氨基胍组在大体形态、HE切片镜下形态接近于正常组，组化染色显示iNOS表达阳性细胞数显著减少(P<0.05)，TUNEL法原位检测显示凋亡阳性细胞数显著减少(P<0.05)。结论 氨基胍能有效减少iNOS表达和软骨细胞的凋亡，延缓OA的病情发展。

【关键词】 氨基胍 骨关节炎 软骨细胞 凋亡 兔 诱导型一氧化氮合酶

　　ABSTRACT: Objective To observe the effect of aminoguanidine by intraperitoneal injection on apoptosis of chondrocyte with osteoarthritis. Methods Totally 32 rabbits were pided into 3 groups at random. Both the experiment and the model groups were fixed by plaster cast in the right hind straighten limb， while the control group received no treatment. The experiment groups were injected with aminoguanidine in abdominal cavity， 100mg/(kg·d)， and the control groups were injected the same voluminal normal saline in abdominal cavity. At the 4th week， we killed 4 rabbits from the normal group， and 6 from the control group and the experiment group， respectively. At the 8th week， we put the rest to death. We drew the materials from each sample for pathological observation on the whole and under the light microscope by HE and immunohistochemical staining， and counted apoptosis cells by TUNEL for statistical analysis. Results Compared with the control group， the experiment group was more similar to the normal group in general observation and optical microscope observation by HE staining. Both iNOS positive expression cell by immunohistochemical staining and apoptosis cell calculation by TUNEL of the experiment group were fewer than those of the control group(P<0.05). Conclusion Aminoguanidine injected in abdominal cavity can depress the production of iNOS， decrease apoptosis of the cartilage cell， and delay or prevent progression of OA.

　　KEY WORDS: aminoguanidine; osteoarthritis; chondrocyte; apoptosis; rabbit; iNOS

　　骨性关节炎(osteoarthritis， OA)是一种老年常见慢性疾病，严重影响患者的生活质量，其重要的病理学特征是关节软骨的降解(包括软骨细胞的数量减少和细胞外基质降解)。早期缺乏有效的特异性治疗方法，往往因症状加重而需行人工关节置换术。现研究证明，OA患者体内一氧化氮(nitric oxide， NO)浓度升高。过高的NO可影响关节软骨的代谢，造成软骨细胞凋亡增多。氨基胍(aminoguanidine， AG)是一种选择性的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)抑制剂，本实验使用AG干预兔OA模型，观察关节软骨的形态变化及软骨细胞凋亡，旨在探讨治疗OA的新途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成熟日本大耳白兔32只，体重2.2-2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。氨基胍硫酸盐由美国Sigma公司购得，iNOS免疫组化染色一抗购自博士德生物工程有限公司，二抗及碱性磷酸酶购自北京鼎国生物技术公司，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自美国罗氏公司。

　　1.2 实验分组 32只兔子随机分为正常组、模型组和氨基胍组。后两组行右后肢伸直位管型石膏固定造模，自由活动，正常喂养。氨基胍组腹腔内注射氨基胍硫酸盐溶液100mg/(kg·d)，模型组每天腹腔内注射相同体积的生理盐水，正常组不予任何处理。密切观察动物，有石膏松动迹象时，予以修复，牢靠固定。

　　1.3 形态观察及HE染色 4、8周时采用空气栓塞法分别处死各组半数动物，取右后肢股骨髁进行大体标本病理学观察后，用40g/L多聚甲醛固定，100g/L EDTA脱钙液脱钙，制备切片，HE染色。

　　1.4 TUNEL法检测细胞凋亡 切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢处理10min，用蛋白酶K于37℃消化15min，滴加25μL的TUNEL反应混合溶液(含末端脱氧核糖核酸转移酶TDT及含有核苷酸混合液)，在湿盒中37℃孵育60min，DAB显色，苏木素复染，封片。阳性对照：在切片置TUNEL反应混合溶液前，先在200ng/mL DNaseⅠ(DNA聚合酶Ⅰ)溶液中37℃下反应15min；阴性对照标记时不加TDT，其余步骤相同。

　　1.5 iNOS的免疫组化染色 切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢甲醇冲洗，磷酸盐缓冲液冲洗，1.25g/L胰蛋白酶消化。加入10mL/L牛血清白蛋白，20℃孵育15min。第一抗体在4℃下孵育18h，第二抗体孵育30min。加标记液(碱性磷酸酶)反应30min，加显色液反应30min，细胞核用苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。

　　1.6 切片观察及统计学处理 光学显微镜10×10倍视野下，于软骨细胞层中随机选取4个视野，分别统计100个细胞内平均iNOS表达阳性细胞数和凋亡阳性细胞数。应用SPSS10.0统计软件，采用方差分析及t检验，检验水准为α＝0.05。

　　2 结果

　　2.1 大体标本观察 正常组关节软骨呈浅蓝白色，半透明，表面光滑，边缘规整，无缺损及裂隙，有弹性，光泽度好，4周和8周无差异。氨基胍组4周时软骨表面呈蓝白色，颜色较深，表面光滑，有光泽，未见缺损及裂隙；8周时软骨表面呈蓝白色，基本光滑，有光泽，未见缺损及裂隙。模型组4周时软骨表面呈淡黄白色，透明度差，表面不光滑、粗糙，可见软骨面的缺损；8周时软骨表面呈黄白色，色泽暗淡，表面粗糙，缺乏弹性，部分标本有较大的缺损和裂隙。

　　2.2 光学显微镜观察 正常组软骨表面光滑，细胞排列规整，层次清楚，细胞无增生肥大，基质染色均匀，未见血管分布。氨基胍组4周时软骨表面光滑，无裂隙，软骨细胞增生、肥大，排列尚好，基质染色基本均匀，未见血管翳生成；8周时软骨表面尚光滑，软骨细胞增生、肥大，层次增厚，排列紊乱，有细胞簇聚现象，深层有血管增生，潮线模糊。模型组4周时软骨表面不光滑，存在局部小凹陷，软骨细胞增生、大小不等，有簇聚现象，排列紊乱，可见灶性溶解、坏死，软骨厚度变薄，潮线前移、紊乱，部分消失，有血管翳生成；8周时软骨表面局部凹凸不平，存在缺损及裂隙，软骨细胞减少，大小不等，簇聚现象明显，可见灶性坏死。软骨厚度明显变薄，基质异染，有较多血管位于深层，潮线多数消失(图1)。

　　图1 不同组兔关节软骨HE染色（略）

　　Fig.1 HE staining of rabbit arthrodial cartilage in different groups (×100)

　　A: normal group; B: model group， 8 weeks; C: aminoguanidine group， 8 weeks

　　2.3 凋亡阳性细胞计量分析 凋亡阳性细胞为散在分布，胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色，凋亡阴性细胞胞核呈蓝色。正常组仅在关节软骨的深层有少量的凋亡阳性细胞散在分布；氨基胍组和模型组凋亡阳性细胞增多，分布于各层(图2)。4周时凋亡阳性细胞数正常组为(4.00±2.58)%，模型组为(21.83±3.06)%，氨基胍组为(15.83±3.76)%，正常组显著低于氨基胍组和模型组(P<0.05)，而且氨基胍组低于模型组(P<0.05)。8周时凋亡阳性细胞数正常组(5.75±1.71)%显著低于氨基胍组(16.83±3.06)%和模型组(43.17±6.65)%(P<0.05)，且氨基胍组低于模型组(P<0.05)。凋亡阳性细胞数氨基胍组4周与8周无显著性差异(P>0.05)，而模型组有显著性差异(P<0.05)。

　　2.4 iNOS表达阳性细胞计量分析 iNOS表达阳性细胞胞质呈均匀红染颗粒，胞核蓝染，胞膜完整。正常组在关节软骨的表层有少量的iNOS阳性表达，模型组iNOS表达增多，主要在表层和中层；氨基胍组iNOS表达增多不明显。4周时iNOS表达阳性细胞数正常组为(4.00±1.83)%，模型组为(13.55±3.51)%，氨基胍组为(6.33±2.58)%，方差分析表明正常组与氨基胍组间iNOS表达阳性率无显著性差异(P>0.05)，正常组、氨基胍组均与模型组间有显著性差异(P<0.05)。8周时iNOS表达阳性细胞数正常组[(3.75±1.71)%]与氨基胍组[(8.50±3.51)%]无显著性差异(P>0.05)，正常组、氨基胍组均与模型组[(41.33±8.33)%]间有显著性差异(P<0.05)。iNOS表达阳性率氨基胍组4周与8周无显著性差异(P>0.05)，模型组有显著性差异(P<0.05)。

　　图2 TUNEL法检测不同组兔关节软骨细胞凋亡（略）

　　Fig.2 Apoptosis of rabbit arthrodial cartilage cells by TUNEL in different groups (×100)

　　A: normal group; B: model group， 8 weeks; C: aminoguanidine gruop， 8 weeks

　　图3 不同组兔关节软骨免疫组化染色（略）
　　
　　Fig.3 Immunohistochemical staining of rabbit arthrodial cartilage in different groups (×100)

　　A: normal group; B: aminoguanidine group， 8 weeks; C: model group， 8 weeks

　　3 讨论

　　3.1 OA动物模型 从制作方法上分为诱发模型和自发模型，前者通过各种操作如关节制动、手术、关节内注射物质等诱导OA产生；后者不用任何外界干预，动物自发产生OA，如C57黑鼠、STR/ort小鼠等。关节固定法简单易行，成功率高，无手术创伤性滑膜炎的干扰，适于研究药物疗效及药物对关节软骨成分、炎症介质、蛋白酶等表达的影响和治疗药物的筛选。Okazaki等[1]实验研究表明，家兔膝关节伸直位制动7-14d后，关节软骨即出现早期退变，28d后出现关节软骨中度退变，42d后则出现严重的退变，国内彭丹等[2]用长腿石膏管型固定家兔膝关节于过伸位，对其关节软骨细胞进行形态学及原位DNA断裂标记研究。发现制动1周时即出现软骨表层细胞凋亡，2周后凋亡呈增加趋势，6周时出现全层软骨细胞大量凋亡，而正常及实验对照组很少出现凋亡细胞，提示制动一段时间可以造成OA。本实验选用关节外固定法观察药物对关节软骨退变的影响，结果表明，兔膝关节伸直位固定后4周，关节软骨出现退变表现，8周时退变更明显，与正常组比较有显著性差异，说明造模成功。

　　3.2 一氧化氮与OA 无机小分子NO是一种生理和病理生理介质[3]，也是一种高反应性细胞毒的自由基，参与各种疾病的组织损伤，由L精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化生成。目前已经确定的一氧化氮合酶有神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)三种，其中eNOS和nNOS因在正常体内存在，各自发挥一定的生理功能，故又称为结构型NOS(cNOS)，活性为Ca2+/钙调蛋白(CaM)依赖性，受细胞内Ca2+浓度的生理调节。iNOS在正常软骨组织中没有表达，但某些细胞因子如白介素1、γ干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和细菌脂多糖(LPS)均能刺激iNOS的表达，一旦iNOS蛋白合成，它的活性是非Ca2+依赖性的，可持续表达，使NO水平升高，并可协同各种细胞因子增加软骨损害[4]。OA发病早期，受损裸露的软骨细胞在周围细胞因子的作用下诱发iNOS蛋白表达，从而导致NO大量释放，进一步促进炎症细胞因子释放，上调基质金属蛋白酶(MMP)的活性和基因表达，抑制胶原的合成，促进胶原的分解[5]，影响软骨的营养交换，最终导致软骨质量不断下降和进行性退化。本实验结果表明，应用iNOS抑制剂氨基胍后，iNOS表达阳性细胞数明显减少，软骨退变进程得到延缓。

　　3.3 软骨细胞凋亡与OA 关节软骨细胞增殖和凋亡在正常情况下处于动态平衡，保障细胞数量及形态和功能的稳定。应用TUNEL技术证实正常人软骨中未发现或仅见少量凋亡细胞。软骨细胞的异常凋亡可引起关节软骨破坏，导致骨关节疾病。软骨细胞凋亡的途径目前研究认为至少有两种，它们之间相互独立。一种是同滑膜炎症无关的途径，由NO介导；另一种是同滑膜炎症相关的途径，由Fas介导，因为并不是所有的OA都存在滑膜炎症反应，因此NO途径在软骨细胞凋亡中的作用更重要[6]。本实验中，氨基胍组与模型组比较，凋亡细胞数明显减少，但仍高于正常组，可能与仅抑制NO途径，而对Fas途径引发的凋亡无效有关。

　　3.4 iNOS抑制剂的应用现状 NOS抑制剂可分为两种类型：选择性抑制剂和非选择性抑制剂。后者是对cNOS及iNOS均有抑制作用，如L单甲基精氨酸(LNMMA)，L硝基精氨酸甲酯(LNAME)，L硝基精氨酸(LNNA)；前者仅对iNOS具有抑制作用，如AG、L刀豆氨酸(Lcanavanine)、S甲基异硫脲(Smethylisothiourea)、LN6(1亚胺乙基)赖氨酸(LNIL)等。近年来，动物模型实验己显示多种NOS抑制剂能减轻关节软骨缺损和滑膜炎的程度[7]。Pelletier等[8]用LNIL治疗骨性关节炎模型，证实可减少骨刺的发生。形态学观察显示减少股骨髁部和胫骨平台软骨缺损的面积达50%，并且大大减轻软骨缺损和滑膜炎的严重程度，显著降低胶原酶和金属蛋白酶在软骨中的活性以及IL1β、PGE2和NO在滑膜液中的水平。但长期应用非选择性的NOS抑制剂，可干扰NO的正常生理浓度，造成其他系统的病理变化且能使侵袭性关节炎病情恶化。如McCartneyFrancis等[9]报道在骨关节动物模型中长期应用氨基酸类抑制剂，不仅没有改善软骨代谢，反而使侵袭性关节炎病情恶化，就与正常NO代谢干扰有关，因此，特异性iNOS抑制剂更有应用价值。氨基胍是近年研究较多的一种具有相对选择性的iNOS抑制剂，是LNMMA对iNOS的抑制作用的7倍[10]，并且是持续抑制 [11]。其选择性主要通过三种机制实现。①AG与iNOS的结合能力较cNOS约强50-500倍；②AG和精氨酸与iNOS催化位点的结合能力相似，但精氨酸与cNOS催化位点的结合能力较AG约强1000倍。在生理情况下，精氨酸即存在于细胞内，因而能保护cNOS不被AG抑制；③AG只有在NOS激活产物存在的情况下才产生抑制作用。iNOS一旦被激活，便能持续产生代谢产物，而细胞内的cNOS在生理情况下是没有活性的，只有当特定刺激物使细胞内游离钙一过性增高时才能被短暂激活，在这种情况下，AG无法对cNOS产生持续的抑制效应。与非选择性NOS抑制剂比较，AG在抑制iNOS病理性表达的同时，很大程度上保留了cNOS的生理功能。

参考文献

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