【摘要】 目的 构建多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-Em14-3-3疫苗，并研究Em14-3-3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法 通过PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT，构建重组质粒pGEX-Em14-3-3；用电穿孔法将该质粒导入Bb，构建多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗。经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达Em14-3-3/GST融合蛋白；SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果 PCR成功扩增出530 bp的Em14-3-3基因；双酶切证实Em14-3-3基因插入pGEX-1λT中；PCR证实重组Bb-Em14-3-3疫苗构建成功；SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了Em14-3-3/GST融合蛋白，表达效率为23%。结论 成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗，重组质粒pGEX-Em14-3-3在大肠杆菌中获得了高效表达，Western blot结果提示表达出的Em14-3-3重组蛋白具有特异抗原性。
【关键词】 多房棘球绦虫；重组Bb-Em14-3-3疫苗；构建；表达
ABSTRACT: Objective To construct recombinant Bb-Em14-3-3 vaccine of Echinococcus multilocularis and to investigate expression efficiency of Em14-3-3 antigen encoding gene in Escherichia coli BL21(DE3). Methods Em14-3-3 antigen gene was amplified by PCR. Then the gene was cloned into Escherichia coli-Bifidobacteria shuttle plasmid pGEX-1λ T containing gluathione-S-transferaze(GST) gene to construct pGEX-Em14-3-3. The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum (Bb) to construct rBb-Em14-3-3 vaccine. The vaccine was identified with PCR and restriction-endonuclease digestion. The expression of pGEX-Em14-3-3 was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) and fusion protein Em14-3-3/GST was examined by SDS-PAGE and Western blot techniques. Results 530 bp gene of Em14-3-3 was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX-1λ T by restriction analysis. rBb-Em14-3-3 vaccine was successfully constructed by PCR and restriction-endonuclease digestion. It was demonstrated with SDS-PAGE and Western blot that the fusion protein Em14-3-3/GST was expressed in E.coli， BL21. The expression efficiency is 23%. Conclusion rBb-Em14-3-3 vaccine of Echinococcus multilocularis was successfully constructed. The plasmid pGEX-Em14-3-3 was highly expressed in E.coli in fused form with GST and this kind of protein shows specific antigenicity.
KEY WORDS: echinococcus multilocularis; recombinant Bb-Em14-3-3 vaccine; construction; expression
多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis， AE)是由多房棘球绦虫(echinococcus multilocularis， Em)的续绦期幼虫寄生在人体肝脏引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病(zoonosis)，研制疫苗是防治该病的有效途径之一。当前，分子生物学技术的发展为研制理想的Em疫苗提供了新方法，将Em外源DNA引入特定疫苗载体构建重组活疫苗，可将保护性抗原传递至宿主免疫系统。Siles［1］发现Em14-3-3蛋白对原发性感染泡球蚴的BALB/c小鼠产生明显的保护性免疫，提示该蛋白具有较高的遗传学稳定性、较强的免疫原性和较好的表面暴露性，适合作为该病疫苗研究的候选分子。Missich［2］等将重组质粒成功转化到双歧杆菌，从而为发展双歧杆菌成为疫苗载体提供了有力的工具。因此，本研究将泡球蚴Em14-3-3抗原编码基因插入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT，构建pGEX-Em14-3-3，用电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum， Bb)，构建重组Bb-Em14-3-3疫苗，研究Em14-3-3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率，为人兽泡球蚴病的免疫预防提供一种有价值的疫苗。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
高保真即用PCR扩增试剂盒、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂、高效感受态细胞制备试剂盒、UNIQ-l0柱式PCR产物纯化试剂盒、丙烯酰胺和DAB显色剂购自上海生工公司；T4DNA连接酶、DNA Marker、BamHⅠ和EcoRⅠ购自Fermentas公司；中分子量蛋白标准购自重庆百萃公司；硝酸纤维素膜(NC膜)及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP IgG)购自北方同正公司；活动性泡球蚴病小鼠血清(一抗)由本室制备。
1.2 DNA模板
pBCG-Em14-3-3［3］由本室构建和保存。
1.3 质粒和宿主菌
大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT购自华西医科大学微生物学教研室；Bb购自武汉大学菌种保存中心；BL21大肠埃希菌由本室保存。
1.4 泡球蚴Em14-3-3基因的扩增
1.4.1 PCR扩增Em14-3-3基因
根据GenBank Em14-3-3(U63643)的DNA序列设计引物，P1：5′-CGGGATCCCTCAATCAGAACCACGAC-3′为上游引物，5′端引入BamHⅠ位点，P2：5′-TCTGAATTCGCCAAACTTGCCGAACAAGC-3′为下游引物， 5′端引入EcoRⅠ位点。引物由上海生工公司合成。以pBCG-Em14-3-3为模板，P1和P2为引物，PCR扩增Em14-3-3基因片段，扩增条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1.5 min，74 ℃延伸3.5 min，共40个循环，最后74 ℃延伸15 min。
1.4.2 PCR产物纯化、电泳鉴定及测序
PCR产物纯化按照PCR产物纯化试剂盒说明书操作，然后取3 μL纯化产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。并以P1和P2为测序引物对克隆的基因进行测序，由上海生工公司完成。
1.5 重组质粒pGEX-Em14-3-3的构建
1.5.1 目的基因和载体大片段的制备
Em14-3-3基因PCR产物和质粒pGEX-1λT分别用BamHⅠ及EcoRⅠ酶双酶切，酶切体系各60 μL：目的基因或载体42 μL、BamHⅠ 1.3 μL、EcoRⅠ 1.3 μL、10×Buffer 6 μL、灭菌去离子水9.4 μL。置37 ℃水浴2 h，酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化。
1.5.2 连接
按照酶切后载体与目的基因约1∶5的摩尔比及T4 DNA连接酶的说明建立20 μL的连接体系：目的基因8 μL、载体大片段8 μL、10×Buffer 2 μL、T4DNA连接酶2 μL。4 ℃过夜后，置70 ℃ 10 min，灭活T4 DNA连接酶。
1.5.3 连接产物的扩增和酶切鉴定
将连接产物转化BL21感受态细菌，37 ℃ 200 r/min振摇培养1 h，随即接种在含50 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃孵育16-18 h，挑取单个菌落至含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃ 200 r/min振摇培养12-18 h，用质粒抽提试剂盒提取重组质粒pGEX-Em14-3-3。然后用BamHⅠ及EcoRⅠ酶对该重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系类似目的基因和载体大片段的制备。
1.6 Bb的培养及转化
取Bb菌种，加入0.2 mL含0.5 mol/L蔗糖的MRS液体培养基，振荡混匀，使冻干粉溶解，将其接种于100 mL上述MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养24-72 h，冰浴2.5 h。4 ℃ 5 000r/min离心10 min，弃上清；加入预冷的100 mL/L甘油50 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，弃上清；加入预冷的100 mL/L甘油25 mL，4 ℃ 2 000 r/min离心10 min，弃上清；加入预冷的100 mL/L甘油10 mL，4 ℃ 1 500 r/min离心10 min，弃上清；加入预冷的100 mL/L甘油1.5 mL，混匀，此细菌可直接用于电转化。取80 μL细菌加入含20 μL重组质粒pGEX-Em14-3-3的Ep管中，混匀，冰浴1 min后转移至电穿孔杯中(规格为0.1 cm)；电穿孔参数设置：电压为1.2 kV、转化时间为5 ms、转化次数为2次，转化完毕后rBb在电穿孔杯中停留5-10 min，加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的MRS液体培养基，轻轻混匀，转入1.5 mL Ep管中，37 ℃厌氧培养2 h。取全部菌液涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，37 ℃厌氧培养72 h。
1.7 重组Bb疫苗的鉴定
取上述筛选培养基上单一的rBb菌落，加入100 mL含0.5 mol/L蔗糖的MRS液体培养基中厌氧培养24-72 h，用质粒抽提试剂盒提取质粒。然后用PCR鉴定重组质粒。
1.8 诱导表达及SDS-PAGE电泳
将经鉴定后的阳性重组质粒转化BL21感受态细菌，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃ 250 r/min振摇培养至吸光度A值0.5-0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养1、3、5、7、9、11、13 h。分别收集1 mL未诱导及诱导表达菌液的菌体，以50 μL的1×蛋白上样缓冲液重悬后煮沸5 min，分别取20 μL进行聚丙烯酰胺凝胶(100 g/L分离胶及50 g/L积层胶)电泳分析，考马斯亮蓝染色。染色后凝胶置Bio Rad Gel Doc 1000凝胶成像仪成像，结果用图像分析系统进行分析。
1.9 免疫印迹分析(Western-blot)
将诱导表达的菌体蛋白作SDS-PAGE后，用半干转移系统将凝胶上的蛋白质转印到NC膜上，于封闭液中室温摇床封闭3 h；用PBS洗涤4次，每次10 min；用封闭液稀释的1∶100活动性泡球蚴病鼠血清室温摇床孵育2 h；用PBS洗涤4次，每次10 min；用封闭液稀释的1∶1 000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温摇床孵育2 h；用含150 mmol/L NaCl和50 mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)的洗涤液洗涤3次，每次10 min；用DAB显色剂对NC膜避光反应10-15 min，蒸馏水终止反应。
2 结 果
2.1 PCR扩增Em14-3-3基因
以pBCG-Em14-3-3为模板，P1和P2为引物进行PCR可扩增出Em14-3-3基因，在500 bp左右可见扩增的目的条带(图1)。扩增的目的条带送上海生工公司测序发现其长度为530 bp，序列分析表明其序列与预期的序列完全相同。
2.2 重组质粒pGEX-Em14-3-3的酶切鉴定
重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后产生约4.9×103 bp的载体片段和500 bp左右的目的基因片段(图2)。
2.3 rBb-Em14-3-3疫苗的鉴定
以从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的重组质粒pGEX-Em14-3-3为模板进行PCR，可扩增出500 bp左右的目的基因片段，与Em14-3-3基因的PCR产物大小一致(图3)。
2.4 重组质粒pGEX-Em14-3-3表达产物的SDS-PAGE分析
SDS-PAGE蛋白电泳结果显示pGEX-Em14-3-3重组质粒在BL21中能高效表达Em14-3-3/GST融合蛋白。其分子量与预期分子量大小相符，约54 ku。用图像软件系统对凝胶上的蛋白带进行分析，Em14-3-3/GST融合蛋白占全菌总蛋白的23%，且在IPTG诱导3-5 h蛋白表达量最高。而未用IPTG诱导的含重组质粒pGEX-Em14-3-3的BL21无相应的目的蛋白条带(图4)。
2.5 Western-blot分析
诱导菌表达的Em14-3-3/GST融合蛋白与活动性泡球蚴病鼠血清反应后，在分子量约为54 ku处产生一特异反应带，未诱菌无此特异条带(图5)。
3 讨 论
两歧双歧杆菌(Bb)是人和哺乳动物回肠末端及大肠内最主要的生理性菌群，是一种益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫调节和营养等多个方面的作用，目前临床上主要用于肠道疾病和肝脏疾病的辅助治疗［4］。为了将外源DNA有效引入双歧杆菌，需构建大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体，这种穿梭表达载体含有双歧杆菌复制起点、大肠埃希菌复制起点、一个多克隆位点和一个筛选标记等，使重组DNA在大肠埃希菌中操作，然后转化双歧杆菌，通过自动复制或同源整合与基因组进行基因交换，在双歧杆菌中稳定表达外源基因。现已报道有表达内皮抑素(endostatin)基因和胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase， CD)基因的双歧杆菌疫苗［5-8］，将它们用于肿瘤的防治均已取得了较好的治疗效果。重组双歧杆菌疫苗具有许多优点：所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫接种，免去了蛋白质后处理的复杂工序；单次接种后即可诱导机体产生针对靶抗原的免疫反应；运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；双歧杆菌本身作为一种益生菌，可提高宿主的免疫力；它价格低廉，易于保存，适于大量生产。
Siles等(1998)用亲和层析纯化法得到一种抗酿酒酵母蛋白14-3-3的单抗，用其扫筛Em原头蚴cDNA文库得到一个阳性克隆Em14-3-3。RT-PCR显示Em续绦期幼虫表达Eml4-3-3蛋白水平是Em成虫的10倍，免疫荧光显示其定位于Em原头蚴的生发层，与泡球蚴无限制浸润生长密切相关。本实验采用pBCG-Em14-3-3作为扩增Em14-3-3的模板，该重组质粒中Em14-3-3基因长度为779 bp［3］，扩增出的Em14-3-3预期产物长度为530 bp，表达27 ku的蛋白质。序列分析发现，Em14-3-3基因的序列与预期的序列(530 bp)完全相同，表明成功克隆出Em14-3-3基因。将Em14-3-3基因定向克隆入穿梭表达载体pGEX-1λT，构建重组质粒pGEX-Em14-3-3，双酶切鉴定证实Em14-3-3基因成功插入pGEX-1λT中。将重组质粒pGEX-Em14-3-3用电穿孔法转化Bb，构建重组Bb-Em14-3-3疫苗，以从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板行PCR能扩增出500 bp左右的基因片段，提示成功构建了重组Bb-Em14-3-3疫苗。
实验采用的穿梭表达载体pGEX-1λT含有GST基因，可将外源基因表达为GST(分子质量为26 ku)的融合蛋白，表达效率高，操作简便。GST分子量大，结构复杂，免疫动物制备抗体时，免疫原性强，用于基础免疫更有利于激发特异性回忆反应［9］。将重组质粒pGEX-Em14-3-3转入BL21中，用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳，在分子质量约为54 ku处有目的蛋白条带，与预期表达蛋白大小(27+1+26=54 ku)相符；而未诱导的BL21无目的蛋白条带，可能是表达的目的蛋白较少，导致SDS-PAGE不能检测。图像软件系统分析发现，Em14-3-3/GST融合蛋白占BL21全菌总蛋白的23%，且在IPTG诱导3-5h蛋白表达量最高，提示重组质粒pGEX-Em14-3-3能在BL21中高效表达，不同的诱导时间蛋白表达效率不同。Western blot分析发现BL21中表达的Em14-3-3/GST融合蛋白可被泡球蚴病鼠血清特异识别，提示BL21中表达的重组抗原能够正确折叠，保持着具有活性的免疫功能区，具有特异抗原性，为多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗的开发利用提供了坚实的理论基础。
参考文献
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