作者：蒋知新，夏爱祥，张清华，方效民，李运田，杜大勇，赖晓辉
【摘要】 目的 探讨炎症因子白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)、白介素-6(interleukin-6， IL-6)对人冠脉平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3， MMP-3)的影响。方法 ①采用20 μg/L的IL-1β、10 μg/L的IL-6各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养0、2、4、8、24、36 h后收集细胞；②采用不同质量浓度的IL-1β(0、5、20、40 μg/L)、IL-6(0、5、10、50 μg/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养6 h后收集细胞。③应用实时荧光定量PCR方法检测细胞内MMP-3基因的表达量。结果 ①在同剂量IL-1β、IL-6刺激下，MMP-3的表达量在2 h时就开始发生上调，8 h达高峰，而后开始下降；②在不同剂量IL-1β、IL-6刺激下，MMP-3的表达量在实验剂量范围内随着剂量的加大呈上升趋势(IL-1β：r=0.907，P=0.000；IL-6：r=0.919，P=0.000)。各因子不同剂量组MMP-3的表达量均具有显著性差异(IL-1β：F＝24.047，P=0.000；IL-6：F＝14.081，P=0.001)。IL-1β 20 μg/L和40 μg/L组间MMP-3表达量没有显著性差异(P=0.154)，IL-6 5 μg/L和10 μg/L组间MMP-3表达量没有显著性差异(P=0.292)。结论 炎症因子IL-1β、IL-6能促进冠脉平滑肌细胞中斑块稳定相关标记物MMP-3的表达，这可能是炎症在急性冠脉综合征发生发展中的重要作用机制之一。
【关键词】 急性冠脉综合征；白介素-1β；白介素-6；基质金属蛋白酶-3；炎症；荧光定量聚合酶链反应
ABSTRACT: Objective To explore the effect of IL-1β and IL-6 on MMP-3 gene expression in human coronary artery smooth muscle cells. Methods We used IL-1β (20 μg/L) and IL-6 (10 μg/L) to stimulate human coronary artery smooth muscle cells， which were co-culture for 0， 2， 4， 8， 24， 36 h. IL-1β (0， 5， 20， 40 μg/L) and IL-6(0， 5， 10， 50 μg/L) were used to stimulate human coronary artery smooth muscle cells， which were co-cultured for 6 h. Then we detected the gene expression by fluorescent quantitation PCR. Results In the same concentration of IL-1β and IL-6， gene expression was up-regulated at 2 h， at 8 h the expression reached the peak， then began to descend. In different concentration of IL-1β and IL-6， gene expression was up-regulated with the dose of IL-1β and IL-6 (IL-1β: r=0.907， P=0.000; IL-6: r=0.919， P=0.000). There were significant differences in MMP-3 expression among different groups (IL-1β: F＝24.047， P=0.000; IL-6: F＝14.081， P=0.001). There were no significant differences in matrix metalloproteinase-3 between IL-1β 20 and 40 μg/L groups (P=0.154) and between IL-6 5 μg/L and 10 μg/L (P=0.292). Conclusion It suggests that IL-1β and IL-6 can promote MMP-3 gene expression in human coronary artery smooth muscle cells， and it may be one of the mechanisms of inflammation effect in acute coronary syndrome.
KEY WORDS: acute coronary syndrome; interleukin-1β; interleukin-6; matrix metalloproteinase-3; inflammation; fluorescent quantitation PCR
大量研究表明炎症在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome， ACS)的发生发展中起着非常重要的作用。ACS的发生和不稳定斑块的破裂有关，不稳定斑块具有较薄的细胞外基质，而基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3， MMP-3)能降解细胞外基质，在斑块从稳定转向不稳定的过程中有着非常重要的作用。本研究应用炎症因子白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)、白介素-6(interleukin-6， IL-6)刺激冠脉平滑肌细胞，观察其中MMP-3的表达变化，从而探讨炎症因素在ACS中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞
人冠脉平滑肌细胞［HCASMC］(Casecade公司)。
1.2 试剂
231培养基、培养基添加剂及胰酶(casecade公司)；IL-1β、IL-6(PeProtech公司)；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(北京北化精细化学品有限责任公司)；Set of dATP、dCTP、dGTP、dTTP、RNasin Ribonuclease Inhibitor、Agarose(Promega， USA)；Oligo(dT)15-18 Primer(上海生工生物科技有限公司)；M-MLV Reverse Transcriptae、TRIZOL Reagent(Invitrogen， USA)；Taq DNA Polymerase、Loading Buffer (TaKaRa， Japan)；溴化乙锭(Sigma， USA)；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems， USA)。
1.3 仪器
MCO-17AI CO2恒温培养箱(SANYO， Japan)；CK2型倒置显微镜(Olympus， Japan)；细胞超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)；Ultrospec 3100pro型紫外分光光度计(Amersham Pharmacia Biotech， UK)；DYC-31D型电泳仪(北京六一仪器厂)；GEL-DOC2000型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad， USA)；PTC200 PCR 扩增仪(MJ， USA)；MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate、MicroAmp 96-WellFull Plate Cover、ABI PRISM Optical Cover Compression Pads、7500型实时荧光定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems， USA)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养及因子刺激
复苏的细胞在37 ℃、体积分数为95%空气和5% CO2的培养箱中培养。实验用5-7代的细胞。将细胞按2.5×105/mL接种于25 cm2的培养瓶中，24 h后换液，培养48 h后细胞接近80%融合时加入因子进行刺激。①应用20 μg/L的IL-1β、10 μg/L的IL-6各自刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养0、2、4、8、24、36 h后收集细胞；②应用不同质量浓度的IL-1β(0、5、20、40 μg/L)、IL-6(0、5、10、50 μg/L)刺激人冠脉平滑肌细胞，6 h后收集上清液和细胞。上清液-70 ℃冻存，细胞用生理盐水冲洗两遍后用TRIzol消化。实验重复两次，分两期完成。
1.4.2 细胞总RNA提取
采用细胞总RNA TRIzol试剂提取RNA，严格按照试剂说明书进行操作。
1.4.3 cDNA的合成 取5 μL总RNA进行逆转录反应，严格按照M-MLV逆转录酶说明书进行操作。
1.4.4 荧光定量PCR
MMP-3引物应用软件自行设计，长度为186 bp，F：5′-TAT GGA CCT CCC CCT GAC TCC-3′，R：5′- AGG TTC AAG CTT CCT GAG G -3′ ；看家基因(GAPDH)为108 bp，F：5′- CAT CCA TGA CAA CTT TGG TAT C -3′，R：5′- CCA TCA CGC CAC AGT TTC -3′(北京赛百胜科技有限公司制备合成)。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，×50循环+95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h 5 min。
1.5 统计学处理
所得数据应用SPSS 11.0软件包进行统计学描述与分析。计量资料用±s表示，多组间比较用one-way ANOVA检验，两两比较应用SNK法检验，并进行Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞总RNA质量及纯度检验
①每份样品取4 μL稀释至400 μL，测定其A260 nm/A280 nm吸光度比值均在1.8-2.0之间，说明所提RNA纯度较高；②取稀释后的RNA 1 μL与Loading Buffer混匀后，在12 g/L的琼脂糖凝胶中电泳图片上可见RNA清晰的18 S和28 S的条带，无弥散，说明RNA质量较好，无明显降解(图1-4)。
2.2 目的基因的表达情况
取细胞总RNA逆转录后，应用2 μL cDNA进行实时荧光定量PCR实验，检测细胞中PAPP-A基因的表达情况。扩增产物的溶解曲线图，峰值单一，说明引物特异性好，目的产物较纯。应用7500型实时荧光定量PCR仪分析软件SDS进行处理分析，经过与管家基因(GAPDH)校正后，得出目的基因产物量比较的结果(图5、图6)。可见在同剂量IL-1β、IL-6刺激下，MMP-3的表达量在2 h时就开始发生上调，8 h左右达高峰，而后开始下降；在不同剂量IL-1β、IL-6刺激下，MMP-3的表达量在实验剂量范围内随着剂量的加大呈上升趋势(IL-1β：r=0.907，P=0.000；IL-6：r=0.919，P=0.000)。各因子不同剂量组MMP-3表达量均具有显著性差异(IL-1β：F＝24.047，P=0.000；IL-6：F＝14.081，P=0.001)。IL-1β 20 μg/L和40 μg/L组间MMP-3表达量没有显著性差异(P=0.154)，IL-6 5 μg/L和10 μg/L组间MMP-3表达量没有显著性差异(P=0.292)。
3 讨 论
冠状动脉粥样硬化斑块的破裂、糜烂、出血并在此基础上促使冠脉痉挛和血栓形成，是ACS重要的发病机制。研究发现斑块的稳定与否主要取决于其性质而不在于其大小。与稳定斑块相比，不稳定斑块具有较大的偏心的不规则脂质核心，纤维帽较薄，并富含炎症细胞及炎症相关细胞，具有较高的不稳定性。纤维帽的厚度、强度及胶原含量是决定斑块稳定性的主要因素，炎症细胞聚集及炎症反应是不稳定斑块的特征性表现。基质金属蛋白酶(MMP)是一组依赖于Zn2+、Ca2+的蛋白酶家族，对细胞外基质成分有较高亲和力，几乎可降解所有ECM成分。近来研究发现ACS患者的血浆，甚至在尿液及唾液中MMP家族成员分泌水平升高，提示它可能参与ACS的病理进程［1-5］。单岩等［6］研究认为MMP-9和MMP-2可作为ACS患者早期诊断及预后疗效的判定指标。Zeng等［7］研究发现血浆MMP9水平和高敏C-反应蛋白水平显著相关，认为MMP系统可能是炎症在ACS中作用的组成部分。Tayebjee等［8］研究发现，高血压患者的MMP-9和金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)在基线水平升高，在进行了心血管危险因素的处理后，MMP-9水平下降，而TIMP-1水平升高，并且MMP水平的升高和高Framingham心血管危险因子的积分显著相关。临床应用血脂康、阿托伐他汀、环氧化酶抑制剂等能够降低ACS患者血浆MMP的水平［9-11］。目前普遍认为MMP能够降解动脉粥样硬化斑块中的细胞外胶原和基质，使纤维帽变薄，对机械外力的抵抗作用减弱，导致斑块趋向于不稳定化并最终破裂，引发ACS。在众多的MMP中，MMP-3显得尤为重要，因为其底物广泛，可以单独降解构成细胞外基质的大部分成分，同时又可以激活MMP-1、MMP-8、MMP-9的活性，共同参与细胞外基质的降解过程。MMP-3 与能够激活的其他酶原形成一正反馈环，在MMP家族激活过程中具有关键作用。刘丹等［12］研究发现MMP-3水平在ACS患者中显著升高。
1999年Ross提出动脉粥样硬化是炎症性疾病，炎症在不稳定斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的作用。尸检发现在不稳定或破裂的动脉粥样斑块内聚集着泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞，其中巨噬细胞数目不稳定斑块是稳定斑块的4倍；在斑块最易于破裂的肩部，炎症细胞浓度最高，均提示炎症导致斑块不稳定，易破裂。研究发现不稳定斑块内的泡沫细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞等炎症细胞聚集［13］，分泌的致炎因子如IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α、γ-抗干扰素、P-选择素、细胞黏附分子-Ⅰ等加速了动脉粥样硬化的过程，且IL-1β、IL-6等炎症标志物在斑块内的表达也明显升高，甚至在全身血循环中的浓度也会升高。本研究应用不稳定斑块中最常见的炎症因子IL-1β、IL-6刺激人冠状动脉平滑肌细胞，结果表明炎症因子能够在基因转录水平上调人冠状动脉平滑肌细胞中MMP-3的表达，并且呈剂量依赖效应。提示不稳定斑块中炎症因子和炎症反应的存在可能是MMP表达上调的原因。正常的纤维帽主要由血管平滑肌细胞分泌的胶原和基质构成，在不稳定斑块中存在的炎症因素刺激斑块和血管结合部位的血管平滑肌细胞表达MMP-3，自身及被其激活的MMP降解细胞外胶原和基质，使斑块纤维帽变薄，导致斑块不稳定性增加，进而破裂引起ACS发病，可能是其作用机制之一。
总之，本研究体外模拟不稳定斑块的局部炎症条件，探讨了IL-1β、IL-6对人冠脉平滑肌细胞表达MMP-3的影响，结果表明炎症因素能够引起MMP-3的上调可能是其作用的途径之一。这为针对炎症作用途径上的治疗和预防提供新的视角和依据。
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