【摘要】 目的 观察血管内皮生长因子C(VEGF-C)及其受体3(VEGFR-3)和肾小球上皮细胞整合膜蛋白(podoplanin)在食管癌组织中的表达，分析其与肿瘤淋巴结转移的关系。方法 免疫组织化学SP法检测76例食管癌组织中VEGF-C、VEGFR-3和podoplanin的表达及淋巴管密度(LVD)。结果 食管癌VEGF-C表达阳性率为63.1%，VEGF-C的表达与食管癌的淋巴结转移、TNM分期有统计学意义(P<0.01， P<0.05)，但与患者年龄、肿瘤大小及分化程度无关；癌旁组织淋巴管密度同淋巴结转移、VEGF-C阳性表达间有统计学意义(P<0.01， P<0.05)，podoplanin LVD值与VEGFR-3 LVD值相比，具有统计学意义(P<0.01)。结论 食管癌组织中VEGF-C表达与肿瘤TNM分期、淋巴管密度和淋巴结转移有关，VEGF-C表达越高，淋巴管密度越大，淋巴结转移可能性越高。癌旁组织LVD同VEGF-C的高表达及淋巴结转移密切相关，食管癌组织中podoplanin标记的淋巴管密度较VEGFR-3标记的淋巴管密度更为精确，是一种更为满意的淋巴管内皮特异性标志物。
【关键词】 食管癌；淋巴结转移；血管内皮生长因子C；血管内皮生长因子受体-3；podoplanin
ABSTRACT: Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factorC (VEGF-C)， its receptor3 (VEGFR-3) and podoplanin in tissue of esophageal cancer， and the relationship between their expression and tumor lymphatic metastasis. Methods Expression of VEGF-C， VEGFR-3 and podoplanin in 76 cases of ESC was detected by immunohistochemical SP method and lymphatic vessel density (LVD) was calculated. Results Positive immunostaining of VEGF-C in esophageal cancer tissue was 63.1%; the expression of VEGF- C was significantly associated with the depth of lymph node metastasis and tumor invasion (P<0.01， P<0.05， respectively)， but not with the patient age， tumor size or differentiation. The average level of LVD was 15.39±5.14， VEGFR-3 marked LVD was 9.27±6.39， and podoplanin marked LVD was 22.09±8.59. There were significant differences (P<0.01). Conclusion There are clinical significance correlations VEGF-C expression， LVD expression and lymph node metastasis in esophageal cancer. The higher VEGF-C expression and LVD expression in esophageal cancer， the higher risk of lymph node metastasis in esophageal cancer; podoplanin marked LVD is more precise than VEGFR-3 marked LVD， and expression of podoplanin correlates closely with high expression of VEGF-C and LVD. It is a satisfactory lymphangial endothelium marker.
KEY WORDS: esophageal cancer; lymphatic metastasis; VEGF-C; VEGFR-3; podoplanin
食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，早期即可发生淋巴结转移。大量实验证明，淋巴结转移是食管癌患者重要的预后因素。但是，目前关于恶性肿瘤淋巴结转移的具体机制尚不清楚。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)家族及其受体是重要的调节途径之一。VEGF-C可通过自分泌途径，引起VEGF受体-3(VEGFR-3)的激活，诱导淋巴管内皮细胞的扩增，形成新生的淋巴管，从而促进淋巴结转移［1-2］。且随着电镜等研究技术的发展，尤其是podoplanin这种新的高度特异性淋巴管内皮标记物的发现为肿瘤淋巴管形成的研究提供了一种新的工具。本研究选择西安交通大学医学院第二附属医院的食管癌手术标本，应用免疫组织化学方法检测了VEGF-C、VEGFR-3和podoplanin的表达，旨在探讨食管癌患者的淋巴组织生成与淋巴结转移的关系及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 临床资料
病例选自西安交通大学医学院第二附属医院心胸外科2006年7月至2007年5月的食管癌患者，共计76例。本组患者术前经胃镜及活检证实为食管癌，行食管癌根治术前未行任何治疗。分别留取食管癌组织、癌旁组织(距癌灶边缘3 cm)，标本用100 mL/L甲醛溶液固定，石蜡包埋。术后经病理学确诊为食管癌的患者，共76例，年龄48-76岁，平均年龄63岁。患者均知情同意，并获得当地医学伦理委员会的同意。
1.2 方法
采用免疫组织化学SP法。兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体、即用型SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人podoplanin单克隆抗体购自英国Serotec公司，操作步骤依试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断
VEGF-C阳性判断标准：VEGF-C定位于细胞浆，癌细胞胞浆成透明或无色者为阴性，胞浆呈棕黄色为阳性。按照Amioka等［3］的评判标准，选染色均匀的癌间质区，在400倍视野下，以着色细胞占视野细胞总数的多少分级。0级：0；1级：<25%；2级：26%-50%；3级：>50%。0级为阴性，1级以上为阳性。
VEGFR-3淋巴管密度的判定标准：内皮细胞形成的条状、隙状等孤立或簇状结构棕黄染色及有管腔者，管腔小于8个红细胞大小按一条淋巴管计数。先于低倍镜(40倍和100倍)下确定3个着色最密集的区域(hot spot)，然后在200倍视野下计数淋巴管，取5个视野的均值作为淋巴管密度(LVD)。
Podoplanin淋巴管密度的判定标准：参照Ohno等［4］和Weidner等［5］的报道方法，先在低倍镜视野下选取肿瘤中心脉管最丰富的区域(即hot spot)，再在×100(2.00 mm2)、×200(0.74 mm2)和×400(0.16 mm2)视野下计数podoplanin阳性脉管数，每例计数3个视野，并求其×200视野下的均值。
1.4 统计学处理
全部数据应用SPSS for window 11.0 版的统计软件作统计学处理。根据不同情况，两组之间均数的比较用t检验，多组之间均数的比较用单向方差分析，频数资料率的比较采用联列表的χ2检验，P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 VEGF-C在食管癌组织中的表达
VEGF-C阳性颗粒主要位于癌细胞胞浆，部分间质细胞中也有表达。76例食管癌病理标本中，癌组织阳性表达48例，占63.1%(图1)。癌旁组织阳性表达51例，占67.1%(表1)。在76例食管癌病理组织中，临床分期为Ⅰ期6例，其中4例VEGF-C表达为阳性；Ⅱ期50例，其中28例VEGF-C表达阳性，22例阴性；Ⅲ期20例，16例VEGF-C表达为阳性，4例阴性。Ⅰ期与Ⅱ期之间无显著性差异(P>0.05)、Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅲ期均有显著性差异(P<0.05)。淋巴结转移组共24例，其中20例VEGF-C呈阳性，4例呈阴性；无淋巴结转移者共52例，其中24例VEGF-C呈阳性，28例阴性，两组之间有显著性差异(P<0.01)。表1 血管内皮生长因子-C与淋巴结转移的关系（略）
2.2 VEGFR-3、podoplanin在食管癌组织中的表达
VEGFR-3和podoplanin主要表达于癌旁组织中，癌组织表达较少。可见VEGFR-3不仅表达于癌旁组织淋巴管内皮上(图2A)，还可以表达于癌旁组织的微血管内皮上(图2B)；而podoplanin则仅在淋巴管内皮上呈阳性表达(图3A)，微血管腔内皮中表达呈阴性(图3B)。癌旁组织平均LVD为15.39±5.14。分别以VEGFR-3和podoplanin为标志计数癌旁组织LVD值：VEGFR-3 LVD为9.27±6.39；podoplanin LVD为22.09±8.59；癌旁组织podoplanin LVD与VEGFR-3 LVD相比，二者具有统计学意义(P<0.01)。
2.3 食管癌组织中淋巴管密度与淋巴结转移的关系
在76例食管癌组织中，Ⅱ、Ⅲ期LVD明显高于Ⅰ期LVD，有统计学意义(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ期LVD之间并无统计学意义(P>0.05)。淋巴结无转移组52例，LVD值为4.47±1.23；淋巴结转移者共24例，LVD值为16.07±4.49，淋巴结转移组LVD表达明显高于无淋巴结转移组，二者有统计学意义(P<0.05)。VEGF-C阳性表达组共48例，LVD值为15.39±5.14，VEGF-C阴性表达组共28例，LVD值为7.63±1.21， 两组间有统计学意义(P<0.05，表2)。表2 淋巴管密度与淋巴结转移的关系（略）
3 讨 论
近年来，肿瘤淋巴管生成的分子机制成为癌细胞淋巴管转移的热点。VEGF-C是VEGF家族的重要成员，是较特异的淋巴管生成因子。肿瘤源性VEGF-C高表达与VEGFR-3结合，可以选择性地引起淋巴管增生，促进肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生，具有促进有丝分裂与增殖的作用，扩大肿瘤侵袭性、增加淋巴结转移的可能性。通过免疫组化染色发现在食管癌组织中VEGF-C主要位于癌细胞的细胞质和细胞膜，阳性率为31%-74%。
在本实验中，对76例手术切除的食管癌病理标本行免疫组化染色，VEGF-C的阳性表达为63.1%，癌旁组织中为67.1%。VEGF-C的表达与性别、年龄、肿瘤大小、病理类型并无统计学意义 (P>0.05)。说明VEGF-C的分泌和表达不受性别、年龄、肿瘤大小、病理类型等因素的影响。临床分期上Ⅰ期与Ⅱ期之间无显著性差异(P>0.05)、Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅲ期间均有统计学意义(P<0.05)。在淋巴结转移上，淋巴结转移组VEGF-C呈高表达状态，阳性率为83.3%，明显高于无淋巴结转移组(41.2%)，二者有显著性差异(P<0.01)。本实验结果再次证实了VEGF-C与食管癌的TNM分期、淋巴结转移有密切关系，VEGF-C的高表达是肿瘤淋巴结转移的一个独立预后因素［6］，VEGF-C的表达可直接或间接地促进食管癌淋巴结的转移［7］。
本实验对LVD进行分析时发现，癌旁组织的平均LVD(15.39±5.14)明显高于癌组织(7.58±4.29)。在性别、年龄、病理分型上，LVD的表达无显著性差异。在临床分期上，Ⅱ、Ⅲ期LVD均明显高于I期LVD，有统计学意义(P<0.05)，而Ⅱ、Ⅲ期LVD之间并无统计学意义(P>0.05)。淋巴结转移组中LVD(16.07±4.49)明显高于无淋巴结转移组(4.47±1.23)。VEGF-C阳性表达组LVD(15.39±5.14)，明显高于VEGF-C阴性表达组(7.63±1.21)。证实了VEGF-C通过旁分泌作用于淋巴管内皮上的VEGFR-3，导致微淋巴管内皮细胞的增生和微淋巴管的延伸，而微淋巴管的增多，肿瘤细胞进入淋巴管的机会增多，导致淋巴结的转移的可能性增大。
VEGFR-3是高度糖基化的细胞表面Ⅲ类酪氨酸激酶受体。此前一直认为VEGFR-3可作为淋巴管内皮特异性标志物，一些研究也证实了VEGFR-3淋巴管表达的特异性。然而，近期越来越多的研究表明，除淋巴管内皮细胞外，VEGFR-3也可表达于：①某些部位的内皮细胞；②正常乳腺、纤维腺瘤及导管癌的毛细血管；③慢性感染性伤口的血管内皮；④神经胶质瘤及结肠癌中增殖的血管。目前认为，虽然多数情况下VEGFR-3特异性地表达于淋巴管内皮细胞，但因其在肿瘤组织中可表达于新生的毛细血管，故不适宜单独作为淋巴管标志物用于肿瘤淋巴管生成的研究［8］。
肾小球上皮细胞整合膜蛋白(podoplanin)为肾小球足状突细胞膜表面蛋白，静脉注射podoplanin抗体可引起蛋白尿及足状突细胞肿胀。提示podoplanin可能与维持肾小球通透性以及足状突细胞突起的形态有关。光镜及免疫电镜研究已证实podoplanin特异性表达于皮肤的淋巴管内皮，而血管内皮不表达。超微研究还表明，podoplanin主要表达在淋巴管内皮的腔面。1997年，Breiteneder等［9］首次提出podoplanin可作为淋巴管内皮标志物。Podoplanin对于淋巴管内皮的具体作用目前尚不清楚，推测可能与调节淋巴管通透性或维持淋巴管形态有关［10］。
本实验中，还重点对比观察了VEGFR-3和podoplanin在食管癌组织中表达的差异，发现VEGFR-3在癌组织、癌旁组织中并非仅仅特异表达于淋巴管内皮，部分微血管管腔内皮上也可呈阳性。Podoplanin则特异表达于癌旁的微小淋巴管内皮上，癌组织表达较少，邻近充满红细胞的血管内皮上呈阴性表达［11-12］。分别以VEGFR-3和podoplanin为淋巴管标记来计数LVD，podoplanin标记的LVD明显高于VEGFR-3 LVD。由此可见，podoplanin作为淋巴管标志物有更高的敏感度和特异度，是一种更为满意的淋巴管内皮标志物。
综上所述，VEGF-C、VEGFR-3、podoplanin与食管癌组织中的淋巴管生成及转移密切相关。VEGF-C有望成为判断食管鳞癌淋巴结转移及预后的指标之一，podoplanin有望取代VEGFR-3成为全新的淋巴管内皮标志物，利于进一步研究肿瘤淋巴管生成的分子机制。
参考文献
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