作者：任莉，苌新明，王云，焦明丽，常远鸿
【摘要】 目的 观察醛固酮及螺内酯对活化的肝星状细胞(HSC-T6)作用后不同时间段MMP-2和TIMP-1mRNA的表达情况。方法 采用RT-PCR的方法测定HSC-T6中MMP-2、TIMP-1mRNA的表达。结果 活化的HSC可表达MMP-2及TIMP-1的mRNA。醛固酮组MMP-2、TIMP-1的mRNA在48、72 h表达均高于对照组，在作用24、48、72 h时MMP-2、TIMP-1的mRNA的表达随时间递增。而螺内酯组则相反。醛固酮加螺内酯组与单加醛固酮组相比MMP-2、TIMP-1的mRNA表达下降。结论 醛固酮可能通过促使MMP-2及TIMP-1mRNA的表达促纤维化，螺内酯可抑制这一作用。
【关键词】 肝星状细胞；金属蛋白酶(MMPs)；金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)；醛固酮(ALD)；螺内酯
ABSTRACT: Objective To investigate the effect of aldosterone (ALD) and spironolactone on the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA in hepatic stellate cells (HSC) at various time. Methods The expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA was measured by RT-PCR in HSC-T6. Results Activated HSC could express MMP-2 and TIMP-1 mRNA. The expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA increased at 48 h and 72 h in ALD group. At 24 h， 48 h and 72 h， MMP-2 and TIMP-1 mRNA expression increased with the passage of time. Comparing that in spironolactone plus ALD group with ALD group， the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA decreased at 48 h and 72 h. Conclusion ALD can promote hepatic fibrosis by increasing the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA， while spironolactone can inhabit the above-mentioned function of ALD.
KEY WORDS: hepatic stellate cells (HSC); matrix metalloproteinase (MMPs);tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs); aldosterone (ALD); spironolactone
肝纤维化是慢性肝病发展的共同归宿，细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和降解不平衡是其形成的主要原因。其中肝星状细胞(hepatic stellate cells， HSC)的活化是纤维化发生的中心环节［1］。活化的HSC可大量生成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层黏蛋白(laminin， LN)、纤维连接蛋白(fibronectin， FN)、透明质酸(hyaluronic acid， HA)等多种ECM成分并合成金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)及金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)以及多种细胞因子及炎症介质，促进纤维化发展［2］。MMPs和TIMPs在降解ECM中起着重要作用。近几年发现醛固酮(aldosterone， ALD)可致组织器官纤维化［3］，已证明ALD能在肝脏局部合成，并促进HSC合成胶原；动物实验表明ALD能增加一些促纤维化细胞因子的表达［4-7］，并能调节MMPs和TIMPs的活性［8-9］，这一作用可被其拮抗剂螺内酯拮抗［10］，但具体机制尚不清楚。本实验以HSC为研究对象，从基因水平探讨ALD和螺内酯对MMP-2及TIMP-1mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)由第二军医大学张俊平教授馈赠。螺内酯、ALD、二甲基亚砜、DEPC(美国Sigma 公司)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、琼脂糖(美国Gibco 公司)；新生牛血清(杭州赛乐生物工程有限公司)；DNA Marker、2×PCR Taq Mix(广州东盛生物科技有限公司)；Trizol Reagent(Invitrogen 公司)；反转录试剂盒(Fermentas 公司)；PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成(表1)。表1 引物序列及长度（略）
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
HSC-T6传代后培养24 h，选约20%、40%、60%融合的细胞，用无血清培养基培养4 h后换为10 mL/L小牛血清的DMEM培养基并分组：对照组不含干预因素；醛固酮组含1×10-5mmol/L醛固酮；螺内酯组含1×10-6mmol/L螺内酯；醛固酮加螺内酯组含1×10-5mmol/L和1×10-6mmol/L的醛固酮和螺内酯，分别培养72、48、24 h。各组均设复孔三个。
1.2.2 用RT-PCR检测各组细胞中MMP-2及TIMP-1的RNA表达
按试剂盒说明提取细胞总RNA。用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和A260/280的比值；将提取的RNA在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳(200 V，30 min)，检查18 S和28 S带的存在。cDNA的制备按反转录试剂盒说明进行。PCR反应体系：2×PCR Taq Mix(100 mmol/L KCl；20 mmol/L Tris-Cl；3 mmol/L MgCl2；0.2 g/L明胶)12.5 μL。Primer 1(10 μmol/L)1 μL，Primer 2(10 μmol/L)1 μL，cDNA模板1.0 μL，ddh3O加至总体积25 μL。分别按不同条件扩增目的基因片段。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，以DNAMarker作为分子量标准，所得结果拍照并进行灰度值扫描。
1.2.3 统计学处理
行灰度值分析时，以目的条带与内参条带的吸光度比值(MMP-2/β-actin、TIMP-1/β-actin)代表目的基因mRNA相对水平。实验数据以±s表示，应用SPSS11.0统计分析软件，采用t′检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 MMP-2和TIMP-1的mRNA在对照组各时间段的表达结果
MMP-2和TIMP-1的mRNA在对照组各时间段均有表达(表2-表3)。表2 各组24、48、72 h的MMP-2 mRNA表达（略）
2.2 各组MMP-2和TIMP-1的mRNA在作用48 h和72 h的表达
醛固酮组表达均高于对照组(P<0.05)；且在72 h内，TIMP-1的mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01)。螺内酯组的mRNA表达均低于对照组(P<0.05)。醛固酮加螺内酯组与单加醛固酮组相比mRNA的表达明显降低(P<0.05)；但与对照组相比无统计学意义(表2-表3、图1-)。
2.3 各组MMP-2和TIMP-1的mRNA在作用24 h的表达结果及比较
醛固酮组及螺内酯组与对照组相比均无明显增高(P>0.05，表2-表3、图1-)。表3 各组24、48、72 h的TIMP-1 mRNA表达（略）
2.4 MMP-2和TIMP-1的mRNA在ALD作用不同时间的表达
随时间的延长，其mRNA的表达均持续增加(P<0.05)：72 h>48 h>24 h(表4、图1-)。表4 ALD组24、48、72 h MMP-2和TIMP-1的mRNA表达（略）
3 讨 论
明胶酶MMP-2主要参与基底膜Ⅳ型胶原的代谢，降解正常肝窦基底膜，破坏肝脏细胞生存的内环境，激活HSC，促进肝纤维化的发展。研究证明，在肝纤维化过程中，MMP-2在早中期明显升高，降解正常基底膜，促进ECM大量合成，晚期则明显降低，又由于MMP-1活力未相应提高，以致于间质胶原(尤其是Ⅰ型胶原)降解减少，ECM合成超过降解，导致胶原大量在组织中沉积［11］。Takahara［12］用Northern杂交法检测人纤维化肝脏中MMP-2比正常对照组高1.4倍。Hayasaka［13］在大鼠肝纤维化模型中发现MMP-2基因表达增加，酶图法显示活化的MMP-2在肝纤维化过程中增加了13-18倍，活化形式和总体之比在早期均升高，中期最高，硬化期下降。对原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis， PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis， PSC)患者肝组织内检测发现MMP-2 mRNA较正常肝组织升高3-4倍［14］。
MMPs的抑制物TIMPs在肝脏中主要有TIMP-1和TIMP-2两种。TIMP-1可特异性地结合激活的MMP-1，从而抑制其对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解，使ECM沉积。已证明在肝纤维化的发生、发展过程中TIMP-1基因表达逐渐增强，肝硬化阶段达到高峰。Murawaki等研究示肝硬化患者肝组织内TIMP-1水平较正常升高41倍。Benyon则进一步在基因和蛋白水平证明肝纤维化时TIMP-1高于正常对照组。Muksina［15］发现慢性肝病患者肝脏内TIMP-1水平与门脉周围坏死、炎症、肝纤维化程度明显相关，肝组织内TIMP-1水平随肝纤维化的进展逐渐升高。
已发现ALD具有致器官纤维化的作用。目前发现ALD能促使肝脏中Ⅰ、Ⅳ型前胶原合成增加，还可增加明胶酶的活性；在心衰病人中MMPs与TIMPs比值改变及血浆MMP-9水平增加也得到证明［16］。Rombout［17］等用不同浓度的醛固酮作用于培养的肝星状细胞，以特异性免疫沉淀、磷显像法检测发现Ⅰ、Ⅳ型前胶原合成明显增加，认为醛固酮发挥其促肝纤维化作用与肝星状细胞有关。此外，有研究者发现醛固酮在早中期时促肝纤维化作用明显，而晚期时不明显。
螺内酯是醛固酮的竞争性拮抗剂，可通过拮抗ALD的作用抗纤维化。研究证实螺内酯能抑制多种致纤维化的细胞因子，降低胶原合成［18-21］，在肝脏能抑制HSC的增殖。本实验室张盈涛等［22］用CCl4制造肝纤维化大鼠模型，发现随着纤维化程度的加重，血清及肝组织中醛固酮水平不断上升，肝组织内胶原增生明显，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)、血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor， PDGF-BB)和α-平滑肌肌动蛋白(α-aortic smooth muscle， α-SMA)表达增强。与其相比，螺内酯预防组胶原面积减少，血清HA、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及LN显著降低，TGF-β1、PDGF-BB和α-SMA表达减少。
HSC的活化及MMPs对ECM的降解在肝纤维化发展中起重要作用。本实验的研究对象采用与HSC的形态学及功能相似的HSC-T6永生化大鼠细胞株。本实验不同时间段对照组中HSC-T6中均有MMP-2及TIMP-1 mRNA表达。符合先前关于活化的HSC具有表达上述蛋白的作用的理论。在ALD干预组，48 h、72 h的MMP-2及TIMP-1的mRNA表达均高于对照组(P<0.05)，且在72 h时，TIMP-1的mRNA表达显著高于对照组(P<0.01)，这与其他研究者的结果一致。考虑ALD通过促使MMP-2的表达，发挥MMP-2激活HSC及降解正常基底膜的作用，致ECM大量沉积在组织中，促纤维化发展；同时，醛固酮明显增加HSC中TIMP-1的表达，表明其是通过上调TIMP-1，加强对MMP-13(MMP-13主要存在于大鼠中，人体内较多的是MMP-1)活性的抑制而减少降解Ⅰ、Ⅲ型胶原促纤维化。在各个时间段之间比较中还显示出：醛固酮对两种蛋白mRNA的促表达作用具有时间依赖性，随时间的延长表达增加。在螺内酯单独作用组MMP-2和TIMP-1的mRNA与各自对照组相比表达均下降(P<0.05)，进一步证明活化的HSC自身可分泌ALD，并通过结合胞浆和胞膜上的盐皮质激素受体，促进HSC合成MMP-2和TIMP-1，而螺内酯可拮抗ALD的这一作用。说明螺内酯抗纤维化的机制之一是以抑制MMP-2及TIMP-1的mRNA的表达实现的。以前的研究已经证明，螺内酯可降低TGF-β1、IL-1、PDGF等细胞因子，这些因子能增加TIMP-1表达，对MMP-2的表达作用尚存在争议，故考虑螺内酯对MMP-2及TIMP-1的mRNA表达的抑制作用与细胞因子有关，是间接作用的。对它是否能直接引起MMPs及TIMPs表达的变化还有待进一步研究。
参考文献
［1］Carioni V， Romanelli RG， Prinzani M， et al. Focal adhesion kinase and phospholipase C gama involvement in adhesion and migration of humand hepatic stellate cells ［J］. Gastroenterol， 1997， 112(2):522-526.
［2］姜春萌，刘成，刘平. 肝纤维化过程中肝星状细胞的研究进展 ［J］. 中华消化杂志， 2000， 8(20):56-57.
［3］Zannad F， Dousset B， Alla F， et al. Treatment of congestive heart failure:interfering the aldosterone-cardiac extracellular matrix relationship ［J］. Hypertension， 2001，38(5):1227-1232.
［4］Juknevicius I， Segal Y， Kren S， et al. Effect of aldosterone on renal transforming growth factor-beta ［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2004，286(6):F1059-1062.
［5］Lijnen P， Petrov V. Induction of cardiac fibrosis by aldosterone ［J］. J Mol Cell Cardiol， 2000， 32(6):865-879.
［6］Brown NJ， Nakamura S， Ma L， et al. Aldosterone modulates plasminogen activator inhibitor-1 and glomerulosclerosis in vivo ［J］. Kidney Int， 2000， 58(3):1219-1227.
［7］Hayashi MD， Tsutamoto T， Wada A， et al. Immediate administration of mineralocorticoid receptor antagonist spironolactone prevents post-infarct left ventricular remodeling associated with suppression of a marker of myocardial collagen synthesis in patients with first anterior acute myocardial infarction ［J］. Circulation， 2003， 107:2559-2565.
［8］Wilson EM， Gunasinghe HR， Coker ML， et al. Plasma matrix metalloproteinase and inhibitor profiles in patients with heart failure ［J］. J Card Fail， 2002， 8:390-398.
［9］王磊，刘海林，董欣. 醛固酮对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成组织金属蛋白酶抑制因子-1mRNA表达的作用 ［J］. 中华肝脏病杂志， 2004， 12(5):308-310.
［10］Yao Jingfeng， Yao Xixian， Cui Donglai， et al. Effect of spironolactone on expression of MMPs and TIMP-1 in hepatic stellate cells ［J］. J Gastroenterol & Hepatol， 2004， 19(5):A640-A641.
［11］Benyon RC， Iredale JP， Goddard S， et al. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and 2 is increased in fibrotic human liver ［J］. Gastroenterol， 1996， 110(3):821-831.
［12］Takahara T， Furui K， Yata Y， et al. Dual expression of matric metalloprotein-2 and membrane type-1 matric metalloproteinasein fibrotic human liver ［J］. J Hepatol， 1997， 26(6):1521-1529.
［13］Singh KP， Gerard HC， Hudson AP， et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors during the resorption of schistosome egg-induced fibrosis in praziquantel-treated mice ［J］. Immunol， 2004， 111(3):343-352.
［14］Murawaki Y， Yamada S， Ikuta Y， et al. Clinical usefulness of serum matrix metalloproteinase-2 concentration in patients with chronic viral liver disease ［J］. J hepatol， 1999， 0(6):1090-1099.
［15］Murawaki Y， Ikuta Y， Idobe Y， et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in the liver of patients with chronic liver disease ［J］. J Hepatol， 1997， 6(6):1213-1219.
［16］Wilson EM， Gunasinghe HR， Coker ML， et al. Plasma matrix metalloproteinase and inhibitor profiles in patients with heart failure ［J］. J Card Fail， 2002， 8(6):390 398.
［17］Rombouts K， Niki T， Wielant A， et al. Effect of aldosterone on collagen steady state levels in primary and subcultured rat hepatic stellate cells ［J］. J Hepatol， 2001， 34(2):230-238.
［18］Davies J， Gavin A， Band M， et al. Spironolactone reduces brachial pulse wave velocity and PIIINP levels in hypertensive diabetic patients ［J］. Br J Clin Pharmacol， 2005， 59(5):520-523.
［19］Trachtman H， Weiser AC， Valderrama E， et al. Prevention of renal fibrosis by spironolactone in mice with complete unilateral ureteral obstruction ［J］. J Urol， 2004， 172(4 Pt 2):1590-1594.
［20］徐贵平，苌新明，和水祥. 大剂量螺内酯对大鼠肝纤维化进展及血管紧张素Ⅱ水平的影响 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)， 2004， 4(25):151-153.
［21］贾皑，苌新明，张盈涛，等. 螺内酯对实验大鼠肝组织TGFβ1、PDGF-BB及α-SMA表达的影响 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)， 2004， 25(1):64-67.
［22］Zhang Yingtao， Chang Xinming， Li Xin， et al. Effective of spironolactone on the expression of Ⅰ/Ⅲ collagen proteins in rat hepatic fibrosis ［J］. World Chin J Disgestol， 2001， 9(10):1120-1124.