作者：王金堂，贾光辉，刘广宇，张银刚，贾秀红，李萌，张宏
【摘要】 目的 探讨雌激素受体(ER)基因多态性在陕西关中地区汉族绝经后妇女中的分布及其与骨密度的相关性。方法 通过对1 200例陕西关中地区汉族绝经1-4年、年龄48-56(平均53)岁的妇女测定其不同部位的骨密度(BMD)值，并对每个样本测其血钙、血磷、甲状旁腺激素(PTH)及尿Ⅰ型胶原交联N末端肽(NTX)水平，同时检测雌激素受体基因PvuⅡ、XbaⅠ位点的多态性，方差法分析ER基因多态性与骨密度的相关性。结果 雌激素受体基因PvuⅡ酶切多态性位点的三种基因型间在股骨颈和Ward三角的BMD存在着显著性差异(P<0.001)。雌激素受体基因XbaⅠ酶切多态性与各检测指标无显著性差异(P>0.05)。结论 雌激素受体基因PvuⅡ多态性可能对陕西关中地区绝经后妇女股骨颈和Ward三角BMD有一定的影响，雌激素受体基因XbaⅠ基因型与骨密度间无明显相关性。
【关键词】 骨质疏松；雌激素受体；基因多态性；骨密度；绝经后妇女
ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between polymorphism of the estrogen receptor (ER) gene and bone mineral density (BMD)， and bone metabolism in the healthy postmenopausal women from Guanzhong area， Shaanxi Province. Methods In 1 200 postmenopausal healthy Han women， aged 48-56 years (average 53 years)， BMD of lumbar spine and femoral neck， Ward’s and trochanteric areas were measured by dual energy X-ray absorptiometry. Biochemical indexes (serum Ca， serum P， ALP， PTH， CT， urine NTX) were measured and PvuⅡ and XbaⅠrestriction fragment length polymorphism (RFLP) of ER were analysed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The relationship between polymorphism of the ER gene and BMD， and bone metabolism were evaluate by ANCONA. The RFLP was presented as Pp (PvuⅡ) and Xx (XbaⅠ). Results Both the femoral neck and Ward’s triangle BMD values in women with the p carrier genotype were significantly (P<0.001) higher than those in women with the PP genotype， but others had no significant difference. No significant effect of the XbaⅠ genotype on BMD and biochemical indexes was found at any site (P>0.05). Conclusion Our results suggest that the PvuⅡ polymorphism and the ER-α haplotype may be associated with BMD at several femoral neck and Ward’s triangle sites in postmenopausal women of Guanzhong area， Shaanxi Province.
KEY WORDS: osteoporosis; estrogen receptor; polymorphism; bone mineral density; postmenopausal woman
骨密度(bone mineral density， BMD)是反映骨质疏松症骨量减少以及评价骨质疏松性骨折较为可靠的指标之一。骨密度的改变受环境和遗传等多种因素的影响。其中维生素D受体基因约占遗传因素的75%［1］，而雌激素受体(estrogen receptor， ER)基因也对骨密度有一定的影响。研究发现雌激素受体突变可导致骨密度明显下降，因此ER基因已成为骨质疏松的一个重要的候选基因［2］。Kobayashi等［3］在2002年报道了日本绝经后妇女的骨密度与ER基因的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)有关。我们在本研究中采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism， PCR-RFLP)方法，通过研究雌激素受体(ER)基因多态性在陕西关中地区汉族绝经后妇女中的分布及其与骨密度的相关性，从而为进一步探讨原发性骨质疏松症发病的分子机制提供客观依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象与入选标准
研究对象均为在陕西关中地区居住三代以上、无亲缘关系、无外地长久居留史的绝经后健康汉族妇女，年龄在48-56岁之间，平均年龄53岁，且绝经年限大于一年，肝、肾功能正常，无原发性甲状旁腺功能亢进，无其他系统性疾病，无服用影响骨代谢的药品及影响骨代谢的疾病。全部入选对象填写健康调查表。最终样本量为1 200例。
1.2 骨密度的测定
采用双能X射线骨密度吸收仪(DEXA，美国Norland XR-36，CV为1%)测腰椎(L2-L4)、右股骨颈、大转子和Ward’s三角骨密度，并使用亚洲人骨密度检测分析软件。测定髋部骨密度时，按固定设计旋转纠正腿部位置。每日开机后均用模体校正，错误率为0.5%，常年错误率<1%。
1.3 骨代谢相关生物化学指标的测定
尿Ⅰ型胶原交联N末端肽(naltrexone， NTX)的测定采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)。ALP的检测采用日本HITACHI公司7170型全自动生化分析仪。甲状旁腺激素(PTH)的检测采用Sandwich检测法。血钙和血磷按实验室常规检测。
1.4 DNA的提取
采取外周全血2 mL，用蛋白酶K消化，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天为时代公司)提取基因组DNA。
1.5 对提取到的DNA进行PCR反应
引物设计参照文献［3］，并由北京奥科生物工程公司合成。正引物序列为5′-CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC-3′，负引物序列为5′-TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA-3′。反应体系：总体积25 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL(5 u/μL)、dNTP 1 μL(2.5 μmol/L)、P1(引物1)1 μL(浓度5 μL/mL)、 P2(引物2)1 uL(浓度5 μL/mL)、10×PCR缓冲液2.5 μL、甘油2.5 μL、MgCl2 1.5 μL、纯水、基因组DNA 11 μL、模板4 μL。94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，61 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；循环完成后72 ℃再延伸10 min，至4 ℃，备用。
1.6 酶切反应
PCR扩增产物包括ER基因的内含子1与外显子2，用限制性内切酶PvuⅡ、XbaⅠ(华美公司)消化，酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在1.3 kb片断中检测PvuⅡ和XbaⅠ的多态性位点。
1.7 统计学分析
数据以均值±标准差(±s)表示；使用χ2检验分析等位基因频率分布是否符合Hardy-weinberg定律；采用协方差分析(ANCONA)方法，对各部位BMD值及相关的生物化学指标经对有关影响因素调整后，分析所有受试者与ER基因PvuⅡ、XbaⅠ多态性的关系。以上采用SPSS11.5统计软件进行显著性检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 雌激素受体基因的RFLP的检测结果
XbaⅠ酶切出现3种基因型：缺乏XbaⅠ酶切位点的XX型(1.3 kb处一条带)，杂合子Xx型(1.3 kb、910 bp、390 bp处三条带)，存在XbaⅠ酶切位点的xx型(910 bp、390 bp处两条带)；PvuⅡ酶切出现3种基因型：缺乏PvuⅡ酶切位点的PP型(1.3 kb处一条带)，杂合子Pp型(1.3 kb、850 bp、450 bp处三条带)，PvuⅡ存在酶切位点的pp型(850 bp、450 bp处两条带)(图1)。等位基因频率均符合Hardy-weinberg遗传平衡定律
表明各基因频率已达到遗传平衡，具有群体代表性。其中以Pp、Xx基因型为最多见。
2.2 雌激素受体基因基因型频率分布与BMD、骨代谢相关生物化学指标的关系
PvuⅡ基因型与股骨颈、Ward三角BMD之间存在显著性差异(P<0.001，表1)，但是在年龄指标及大转子、腰椎BMD指标、生化指标(甲状旁腺激素、碱性磷酸酶、血钙、血磷、尿NTX)之间不存在显著性差异(P>0.05，表1、表2)，雌激素受体基因PvuⅡ多态性Pp可能对中国绝经后妇女股骨颈和Ward三角BMD有一定的影响。XbaⅠ基因型与各部位骨密度及骨代谢相关生物化学指标间没有显著性差异(表3、表4)。表1 雌激素受体基因PvuⅡ位点多态性与骨密度的关系（略）表2 雌激素受体基因PvuⅡ位点多态性与骨转化相关生物化学指标之间的关系（略）表3 雌激素受体基因XbaⅠ位点多态性与骨密度的关系（略）表4 雌激素受体基因XbaⅠ位点多态性与骨转化相关的生物化学指标之间的关系（略）
3 讨 论
骨质疏松症是一种多因素病症。该病的骨量降低是环境因素与遗传因素相互作用的结果。即使在相同生理环境下，是否发病仍存在个体差异。近年来遗传因素日益受到重视。它在骨质疏松的发生中占50%-70%［2］。遗传因素对骨密度的影响可能有两种作用方式，即结构水平上的作用和通过调节骨代谢或骨转换的作用。在双生子及其家系的研究中显示，85%的骨密度的差异是由遗传因素所决定的［4］。自Morrison等［5］在1994年报道了维生素D受体基因与BMD密切相关后，研究人员又陆续发现了骨质疏松的其他相关基因如雌激素受体基因、骨钙素等位基因、甲状旁腺素基因等。近年来，ER基因成为国内外研究的热点。一些学者对雌激素受体基因的多态性分布与一些疾病的相关性进行了研究。国外初步的研究结果表明：ER基因多态性分布与原发性骨质疏松［6］、子宫内膜异位症［7］、乳腺癌［8］等疾病存在相关性。因此，研究我国妇女ER基因多态性分布及与骨密度的相关性对绝经后骨质疏松的防治有一定的意义。由于ER基因型第一内含子里含有增强子、启动子等重要的调控序列，其发生突变有可能影响到ER的表达和功能，故目前对ER基因多态性的研究多集中在Pvu和Xba的多态性上［9］。
目前，国内外虽对ER基因与骨密度及骨代谢指标关系有了较为深入地研究，但这些研究结果却不尽一致，有时甚至得出相反的结论。日本学者的研究表明，日本人XbaⅠ和PvuⅡ限制性片段长度多态性的PPxx基因型与椎骨BMD相关［3］ ，而韩国学者则认为韩国人的ER 基因型与BMD没有显著的相关性［10］，比利时人的研究结果也表明ER基因型与BMD没有相关性［11］。在国内，王钦红等［12］研究发现中国上海地区绝经后健康妇女ER基因多态性与股骨大转子部位的骨密度显著相关，p等位基因具有一定的骨量保护作用。关菁等［13］研究发现北京地区汉族绝经后妇女ER基因PvuⅡ酶切多态性与尺桡骨近端、远端的骨密度无相关性。薛延等［14］研究发现北京地区汉族妇女ER基因PvuⅡ基因型、XbaⅠ基因型与骨密度无显著性关系。我们的研究表明PvuⅡ基因型与股骨颈、Ward三角BMD之间存在显著性差异(P<0.001)，但在年龄指标及大转子、腰椎BMD指标、生化指标(甲状旁腺激素、碱性磷酸酶、血钙、血磷、尿NTX)之间不存在显著性差异(P>0.05)。我们认为雌激素受体基因PvuⅡ多态性Pp可能对中国绝经后妇女股骨颈和Ward三角BMD有一定的影响。另外，我们还发现XbaⅠ基因型与各部位骨密度及骨代谢相关生物化学指标间没有显著性差异(P>0.05)。上述研究结果之所以存在着差异，考虑可能是由种族差异引起的，表明相同的基因型在不同的种族中有不同的表现。至于雌激素多态性通过何种途径引起骨密度的变化，考虑为以下几种原因：可能与内含子与外显子的突变有关，突变导致雌激素蛋白功能改变；或者与邻近雌激素受体的一些未知基因突变有关；或与其他内含子或调节因素有关，通过转录调控影响表达水平；ER基因附近致病位点的连锁不平衡。ER受体基因多态性的研究为原发性骨质疏松症的基因诊断和基因治疗提供了理论基础。
骨质疏松症是一种多因素、复杂的病理过程。ER基因作为骨质疏松发生的一个候选基因，优点就在于其基因突变率较低，而等位基因相关研究是检测疾病相关位点较敏感的方法之一。它不仅能说明决定疾病发生的位点信息，也能说明疾病发生非决定性因素的信息。在本次研究中，我们确认了西安绝经后妇女ER基因PvuⅡ基因型与股骨颈、Ward三角BMD之间存在相关性。因此，可以以基因作为筛选工具，鉴定高危人群，预防性治疗骨质疏松症。同时，也减少了骨质疏松症骨折的危险性，而且还可以根据基因多态性来筛选、判定药物的疗效。与此同时，在本次实验中为最大限度地排除其他因素对本研究结果的影响，我们选择年龄差距较小的绝经后妇女作为研究对象，他们年龄在48-56岁之间，平均53岁，绝经时间至少一年，且饮食习惯无太大差别，也无过胖或过瘦者。
目前，分子生物学研究骨质疏松症方兴未艾，在进一步确定基因与基因、基因与环境交互作用的同时，还应该注意不同基因、不同因素所用的范围和强弱的差异，以便更有针对性地进行骨质疏松症的预防。
参考文献
［1］Shi YC， Worton L， Esteban L， et al. Effects of continuous activation of vitamin D and Wnt response pathways on osteoblastic prolifeation and differentiation ［J］. Bone， 2007， 41(1):87-96.
［2］Greendale GA， Chu J， Ferrell R， et al. The association of bone mineral density with estrogen receptor gene polymorphisms ［J］. Am J Med， 2006， 119(9):S79-S86.
［3］Kobayashi N， Fujino T， Shirogane T， et al. Estrogen receptor α polymorphism as a genetic marker for bone loss， vertebral fractures and susceptibility to estrogen ［J］. Maturitas， 2002， 41(3):193-201.
［4］Dequeker J， Nijs J， Verstraeten A， et al. Genetic determinants of bone mineral content at the spine and radius: A twin study ［J］. Bone， 1987， 8(4):207-209.
［5］Morrison NA， Qi JC， Tokita A， et al. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles ［J］. Nature， 1994， 367:284-287.
［6］Zao LJ， Liu PY， Long JR， et al. Test of linkage and/or association between the estrogen receptor α gene with bone mineral density in Caucasian nuclear families ［J］. Bone， 2004， 35(2):395-402.
［7］Carroll R， Kaufmann-Reiche U， Schmidt A， et al. Effects of a novel selective estrogen receptor modulator (SERM) on cell proliferation and growth in a macaque autograft model endometriosis ［J］. Fertility and Sterility， 2007， 88(Suppl 1):S60.
［8］Hackenberg R， Schulz KD. Androgen receptor mediated growth control of breast cancer and endometrial cancer modulated by antiandrogen- and androgen-like steroids ［J］. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology， 1996， 56(1-6):113-117.
［9］Wang Z， Yoshida S， Negoro K， et al. Polymorphisms in the estrogen receptor β gene but not estrogen receptor α gene affect the risk of developing endometriosis in a Japanese population ［J］. Fertility and Sterility， 2004， 81(6):1650-1356.
［10］Kim JG， Park DM， Lim KS， et al. Association of vitamin D receptor and estrogen receptor gene polymorphisms with bone mass in Korean postmenopausal women ［J］. Fertility and Sterility， 2000， 74(3):S25.
［11］Vandevyver C， Vanhoof J， Declerck K， et al. Lack of association between estrogen receptor genotypes and bone mineral density， fracture history， or muscle strength in elderly women ［J］. J Bone Miner Res， 1999， 14:1576-1582.
［12］王钦红，黄琪仁，周琦，等. 绝经妇女雌激素受体基因PvuⅡ酶切位点多态性与骨密度的关系 ［J］. 中华内科杂志， 2000， 39(11):743-745.
［13］关菁，戴兆亨，沈浣，等.北京地区汉族绝经后妇女雌激素受体基因多态性与尺桡骨骨密度相关性研究 ［J］. 中华妇产科杂志， 2001， 36(1):40-41.
［14］薛延，李东，王芊，等. 北京地区汉族妇女雌激素受体基因PvuⅡ多态性与骨密度的关系［J］. 北京医学，2003， 25(1):6-8.