作者：张殿增，孟列素，王红英
【摘要】 目的 研究佛氏完全佐剂性关节炎(AIA)大鼠外周血单核细胞(PBMC)对Toll样受体4(Toll-like receptor 4， TLR4)、TLR4 mRNA的表达及其与关节炎评分的关系。方法 流式细胞仪测定CD14+TLR4+细胞占CD14+细胞的比例和TLR4-PE的平均荧光强度(MIF)；Northern blot法测定PBMC TLR4 mRNA的表达量。比较造模后15 d与正常对照组和造模后25 d时CD14+TLR4+/CD14+、MIF及其TLR4 mRNA表达量的差异，并用Mann-Whitey U检验分析关节炎评分与TLR4 MIF的相关性。结果 在造模后15 d，CD14+TLR4+/CD14+、TLR4 MIF和PBMC TLR4 mRNA的表达较正常对照组和造模后25 d明显增高(P<0.01)，而且TLR4 MIF与关节炎的评分有明显的相关性(15 d：r=0.826，P<0.01；25 d：r=0.688，P<0.05)。但造模后25 d，CD14+TLR4+/CD14+、TLR4 MIF和PBMC TLR4 mRNA的表达与正常对照组和造模前相比无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR4与AIA发病有密切关系，提示固有免疫反应在类风湿性关节炎(RA)及其他自身免疫性疾病的发病中有重要的作用。
【关键词】 佐剂性关节炎；大鼠；Toll 样受体4；外周血单核细胞
ABSTRACT: Objective To demonstrate the role of innate immunity reaction in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases by studying the expression of toll-like receptor 4 (TLR4) by peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in rats with adjuvant-induced arthritis (AIA) and analyzing the relationship between expression of TLR4 by PBMC and score of arthritis severity. Methods Both the proportion of CD14+TLR4+ cells in CD14+ cells and the mean intensity of fluorescence (MIF) of TLR4+ cells were analyzed by flow cytometry. Expression of TLR4 mRNA by PBMC was determined by Northern blot. CD14+TLR4+/CD14+ ratio， TLR4 MIF and expression of TLR4 mRNA by PBMC in the model group at 15 days after AIA were compared， respectively， with normal control group and model group at 25 days. The correlation between TLR4 MIF and score of arthritis severity was analyzed by Mann-Whitey U test. Results CD14+TLR4+/CD14+ ratio， TLR4 MIF and TLR4 mRNA expression in model group at 15 days after AIA were obviously increased compared with those in control and model groups at 25 days (P<0.01)， and a good correlation between TLR4 MIF and score of arthritis severity was observed (15 d: r=0.826， P<0.01; 25 d: r=0.688， P<0.05)， but no significant difference in model group at 25 days after AIA (P>0.05). It indicated that TLR4 participated in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Conclusion TLR4 expressed by PBMC is closely associated with pathogenesis and pathophysiology of rheumatoid arthritis， which suggests that innate immunity response plays an important role in pathogenesis of RA and other autoimmune diseases.
KEY WORDS: adjuvant-induced arthritis; rat; toll-like receptor 4; peripheral blood monocyte
Toll样受体(Toll-like receptor， TLR)属于I类跨膜蛋白的受体家族，目前在人体已经发现和确定的有10种，鼠类有11种。TLR通过识别病原微生物及其细胞壁的类脂类保守序列——病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern， PAMP)，介导宿主先天性免疫反应，并激活后天获得性免疫反应。TLR4是表达于除T、B淋巴细胞和NK细胞以外的所有免疫细胞的表面，对PAMP具有广谱识别功能［1］。近来的研究发现，葡萄球菌的细胞壁不能使TLR信号传导连接蛋白缺乏的小鼠产生关节炎［2］，TLR4缺乏小鼠关节炎的严重程度明显减轻［3］，在小鼠关节内注射TLR配体可使之产生严重的关节炎［4-7］，在类风湿关节炎(RA)患者的关节内存在由微生物产生的TLR配体。由此我们推测，TLR信号传导系统在RA的发生和发展过程中起着重要的作用。因此，在本研究中，我们通过检测RA小鼠模型外周血单核细胞(PBMC)表面TLR4及其mRNA的表达情况，并分析其与关节炎严重程度的关系，阐明TLR在RA发病和进展中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及模型建立
体重为150-200 g的SD品系大白鼠，雄性，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。群居笼养，供丸剂饲料和自来水，自由摄食饮水。造模时于大鼠尾巴根部注射弗氏完全佐剂，诱发类似于人类RA的关节炎，根据动物耳部、尾部结节的数目和足跖关节肿胀度，按0-4级评分(Score)［8］。
1.2 主要试剂和仪器
CD14-FITC和TLR4-PE单克隆抗体分别购自Genemy Inc和Santa Cruz生物技术公司；RT-PCR所用的酶及其试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。FACSCalibur型流式细胞仪为美国Bacton Dikenson公司产品；ABI PRISM型RT-PCR为美国应用生物系统公司产品；DYY-10型(ECP3000)三恒电泳仪为北京六一仪器厂产品；Gel Doc 2000型全自动凝胶成像仪为美国Bio Rad公司产品。
1.3 方法
1.3.1 流式细胞仪检测PBMC对CD14和TLR4的表达
取SD品系大鼠20只，随即分为正常对照组和模型实验组，每组10只。按上述方法制造RA模型，并于造模后第15天和第25天，用剪尾法采血2 mL，置枸橼酸钠抗凝试管内，300 g离心5 min，去上清，加入红细胞裂解液，静置20 min，300 g离心5 min，去上清，用0.1 mmol/L PBS(pH7.2-7.4)洗两次，再用PBS重悬细胞，并调整细胞密度为5×106/mL。取重悬的细胞100 μL，加于试管底部，并在管底加入CD14-FITC单克隆抗体10 μL、TLR4-PE单克隆抗体5 μL，充分混匀，室温下避光孵育30 min，用流式细胞仪检测CD14+细胞的TLR4的平均荧光强度(MIF)和CD14+TLR4+细胞占CD14+细胞的百分比。测定时，用DCD14-FITC和SSC为横、纵坐标的点图，分离CD14+细胞群并设门，用CD14-FITC、TLR4-PE点图，测定CD12+TLR4+细胞占CD14+细胞的百分比。用TLR4-PE直方图测定TLR4的MIF。
1.3.2 RT-PCR法检测PBMC对TLR4 mRNA的表达
取上述抗凝血，Ficoll法分离PBMC，重悬于PRMI-1640培养基，置12孔塑料皿内中，于5%(体积分数)CO2培养箱中培养(37 ℃)60 min后，Trizol法提取PBMC的总RNA，生物紫外分光光度计测定RNA的纯度和总量。从Blast数据库查取TLR4引物的序列，委托上海博雅公司合成。取RNA样品1.5 μg，测定TLR4 mRNA的表达量。引物序列和反应条件见表1。取PCR产物各4 μL，电泳仪、18 g/L琼脂糖凝胶电泳分离TLR4的PCR产物，β-actin为内参。Northern blot法显示TLR4 mRNA的表达量，全自动凝胶成像仪、Quantity One软件获取blot图像，测定和分析TLR4 mRNA和β-actin的灰度值，并计算两者之间的比值(TLR4 mRNA/β-actin)。表1 TLR mRNA引物序列和RT-PCR反应条件（略）
1.4 统计学处理
实验数据用±s表示，多组间统计学差异性比较用方差分析法(AVONA)，变量间相关性分析用Mann-Whitey U检验。所有统计学处理均采用SPSS 10.0软件进行，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 佐剂性关节炎评分
在造模后15、25 d，模型组动物的体重明显降低(P<0.05)，正常对照组动物的体重增加在正常范围内。造模后15 d动物的关节炎评分明显高于对照组和造模后25 d(P<0.01，表2)。表2 佐剂性关节炎评分结果（略）
2.2 佐剂性关节炎大鼠PBMC对TLR4的表达
造模后15 d，动物的TLR4 MIF明显高于正常对照组和造模后25 d(P<0.01)；造模后25 d与正常对照组和造模前比较虽有所增加，但无统计学意义(P>0.05)。同样，造模后15 d，CD14+TLR细胞与CD14+细胞的比值明显高于正常对照组和造模后25 d；造模后25 d的比值与正常对照组比较，虽然有增加的趋势，但没有明显的统计学差异(图1、图2)。
2.3 佐剂性关节炎大鼠PBMC对TLR4 mRNA的表达
结果显示，造模后15 d，TLR4 mRNA/β-actin比值明显高于正常对照组和造模后25 d(P<0.01)；造模后25 d与正常对照组比较没有明显的统计学差异(图3、表3)。表3 佐剂性关节炎大鼠PBMC对TLR4的表达（略）
2.4 佐剂性关节炎大鼠TLR4 MIF与其关节炎评分的相关性
结果显示(图4)，造模后15 d和25 d，佐剂性关节炎大鼠TLR4的MIF与其关节炎评分有较明显的相关性(r=0.826，P<0.01；r=0.688， P<0.05)。
3 讨 论
RA是一种严重影响人们生活质量和劳动能力的自身免疫性疾病，其发生与发展与遗传、环境以及感染等多种因素有关。过去的观点认为，RA是T细胞介导的自身免疫性疾病，因此产生了许多针对细胞因子(如TNFα、IL-4)的治疗药物和T细胞耗竭剂，并取得了一定的临床疗效。近年又发现，B淋巴细胞也参与了RA的发病及其病理过程，因而开发出了一些针对B细胞的治疗药物，如利妥西单抗(rituximab)和贝利单抗(belimmab)等。但不管怎样，这些治疗方法都不能根治RA，而且对有些病例的疗效很差［9］。这就提示我们，除了T、B细胞介导的获得性免疫反应以外，可能还有另外一些免疫途径参与了RA的病理生理过程。近年的研究发现，TLR在自身免疫性疾病，特别是RA的发病中有重要的作用［1，11］。因此认为，先天性免疫反应可能也参与了RA的发病过程，而且日益受到人们的关注。
机体的免疫反应包括两种机制，一种是由巨噬细胞和树突状细胞(DC)介导的先天固有的免疫反应，另一种是由T、B细胞介导的后天获得性免疫反应。生物机体识别外源性物体，并激活免疫系统清除这些外源性物体时需要某种物质的介导，分布在各种免疫细胞表面的TLR就是其中之一。
TLR4主要表达于除T、B细胞和NK细胞以外的各类免疫细胞的表面，其主要配体除脂多糖(LPS)外，还包括呼吸道合胞病毒蛋白F、透明质酸酶、硫酸肝素、纤维蛋白原、酵母多糖、白色念珠菌以及宿主的热休克蛋白60、纤维连接蛋白等［13］。业已证实，RA患者关节内有微生物源的TLR配体肽糖酐、双链DNA［7］，TLR4缺乏小鼠的关节炎评分明显减少［2］；活动期RA患者PBMC对TLR2的表达明显增加，并与RA严重程度的评分密切相关；在关节周围也存在一些可以被TLR4识别的PAMP。本研究结果显示，在鼠尾根部注射佛氏完全佐剂、制造RA模型后15 d，模型组动物CD14+TLR4+细胞的比例和TLR4的MIF明显高于对照组和造模后25 d(P<0.01)，PBMC对TLR4 mRNA的表达也表现出同样的结果。但是，在造模后25 d，CD14+TLR+细胞的比例、TLR4的MIF以及TLR4 mRNA表达量较正常对照组没有明显的统计学差异。在分析TLR4 MIF与关节炎评分之间的关系时发现，造模后15 d，TLR4 MIF与关节炎评分之间有明显的相关性。
一般认为，佛氏完全佐剂性关节炎在潜伏期后所发生的关节炎症，耳、尾部结节形成属于迟发性免疫反应引起的炎症反应，相当于RA的活动期［7］。本研究结果显示，造模后15 d，即RA活动期TLR4的表达增多，说明机体固有的免疫系统业已处于活化状态。单核细胞是机体的一线防御系统，在进入关节前处于一种活化状态，并表达可以识别PAMP以及与PAMP相似的关节组织成分，启动自身免疫反应［14］。活化的PBMC迁徙至病变的关节内，转化成巨噬细胞，通过TLR受体识别关节内的PAMP，活化JNK、p38和NFκB信号传导通路，启动机体的炎症反应，并活化获得性免疫系统，合成和释放许多炎症因子，最终导致关节组织和骨组织的破坏。
本实验结果还提示，在造模后25 d，相当于RA的稳定期，动物的PBMC TLR4及其mRNA的表达明显降低，关节炎的严重程度也随之降低。一般佛氏完全佐剂性关节炎的病程为30-35 d。造模后晚期，由于获得性免疫系统的激活，外周的外源性致病因子消除殆尽，PBMC的活性降低，对TLR4的表达也减少，随之免疫反应的强度有所降低或者消失，同时PBMC的侵袭性也降低，这可能是造模后晚期关节炎评分减少的原因。有研究证实，TLR信号传导通路中的接头蛋白髓样分化因子88(MyD88)基因缺陷动物的关节滑膜炎症和骨组织的破坏明显减轻［3］，说明TLR4也参与了关节滑膜和骨组织的破坏，同时提示，MyD88可能会成为RA治疗的新靶点［13］。
综上所述，机体固有的先天性免疫系统参与了RA的病理过程。当外源性病原体入侵时，先天性免疫系统活化，促使PBMC高度表达TLR，启动机体固有的免疫反应，继而激活后天获得性免疫系统，导致RA发生。因此，进一步研究TLR的功能，了解RA的发病机制，不仅为RA的治疗提供新的思路和战略，也为治疗RA的药物研究和开发开辟新的途径。
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