氧化苦参碱对慢性肾脏病患者血清MMP9和TIMP1的影响

　　　　 作者：姚钢炼，廖婷婷，周琳，李美如，袁浩峥，桂保松

【摘要】 目的 观察氧化苦参碱对慢性肾脏病(CKD)患者血清基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)的影响，探讨其在肾间质纤维化发生发展过程中的作用和治疗价值。方法 选取健康对照者10例、慢性肾脏病患者40例，根据肾小球滤过率(GFR)分为轻度肾损害组(GFR<90mL/min·1.73m2， CKDⅠ)和中、重度肾损害组(GFR<60mL/min·1.73m2 ，CKDⅡ)，再分层随机抽样，分为常规治疗组和氧化苦参碱组。利用双抗体夹心酶联免疫吸附法分别检测各组治疗前后血清MMP9和TIMP1含量，采用t检验比较两组MMP9和TIMP1水平的差异。结果 经氧化苦参碱干预后，TIMP1水平显著低于常规治疗组，而MMP9水平则显著高于常规治疗组(P<0.05)。结论 氧化苦参碱可下调TIMP1水平，恢复MMP9水平，保持MMP9/TIMP1平衡，减少细胞外基质(ECM)沉积，防止肾间质纤维化。

【关键词】 基质金属蛋白酶9(MMP9)；基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)；慢性肾脏病；肾间质纤维化；氧化苦参碱

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of oxymatrine on renal interstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease and illuminate the mechanism. Methods Totally 40 patients were pided into 2 groups according to glomerular filtration rate (GFR) level: CKDⅠ group and CKDⅡ group. Then each group was pided into 2 subgroups stratifiedly and randomly. They were conventional group and oxymatrine group. ELISA was employed to measure MMP9 and TIMP1 activities in the plasma samples of 40 CKD patients and 10 control subjects. Results The level of TIMP1 was higher in conventional group than in oxymatrine group (P<0.05)， but the level of MMP9 was lower than that in oxymatrine group (P<0.05). Conclusion Oxymatrine could degrade renal interstitial fibrosis by reducing TIMP1 and restaring MMP9 level， maintaining MMP9/TIMP1 balance， and reducing ECM deposits.

　　KEY WORDS: matrix metalloproteinase9 (MMP9); tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP1); chronic kidney disease; renal interstitial fibrosis; oxymatrine

　　肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis)是慢性肾脏病(chronic kidney disease， CKD)发展的最终结果，与慢性肾衰竭进展密切相关。其病理过程与细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和降解失衡、大量积聚有关。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMPs)与维持肾脏ECM的生成和降解密切相关，MMP9能降解多种基质成分，TIMP1是其主要抑制物[1]。
　　
　　氧化苦参碱是豆科槐属植物苦参、广豆根和苦豆子中生物碱的主要成份，具有抗心律失常、抗炎、抗纤维化、抗肿瘤及免疫调节等诸多重要的药理作用[2]，特别是抗组织纤维化作用受到了极大的关注。本研究通过观察氧化苦参碱对慢性肾脏病患者血清MMP9、TIMP1的影响，探讨其在肾间质纤维化发生发展过程中的作用和治疗价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象及分组 所有病例均来自本院肾病内科门诊和住院的非透析患者，符合NKFK/DOQI诊断标准[3]，实验前2周排除肝病、肿瘤及泌尿系统、呼吸系统感染和其他器官纤维化等疾患。
　　
　　根据肾小球滤过率(glomerular filtration rate， GFR)分为轻度肾损害组(GFR<90mL/min·1.73m2，CKDⅠ)和中重度肾损害组(GFR<60mL/min·1.73m2，CKDⅡ)，再从CKDⅠ、CKDⅡ分层随机抽样，分为常规治疗组和氧化苦参碱组。常规治疗组，男性8例，女性12例，平均年龄(53.70±11.4)岁，平均血尿素氮(11.25±4.72)mmol/L，血肌酐(242.28±100.49)μmol/L，GFR(46.96±10.77)mL/min·1.73m2；氧化苦参碱组，男性10例，女性10例，平均年龄(54.40±12.0)岁，平均血尿素氮(11.93±4.56)mmol/L，血肌酐(247.23±104.31)μmol/L，GFR(45.22±11.36)mL/min·1.73m2。两组患者的平均年龄、病程、原发病、症状与体征基本相同，血尿素氮、血肌酐、GFR等指标经统计分析，无显著性差异，具有可比性。

　　1.2 治疗方法 常规治疗组给予病因治疗。血尿素氮、血肌酐升高者给予低蛋白饮食；高血压患者另给予洛汀新(盐酸贝那普利，10mg，每日1次)口服，单用洛汀新降压效果差时加用钙拮抗剂拜新同(硝苯地平控释片，30mg，每日1次)上午8时顿服；贫血患者根据贫血情况予以促红细胞生成素(100-150u/kg·周)皮下注射，富血素、叶酸口服及维生素B12肌肉注射等对症治疗。氧化苦参碱组在获得患者知情同意后，在常规治疗组基础上加用氧化苦参碱治疗，以治疗人肝脏纤维化的剂量为基础，按药理常用剂量[4]。氧化苦参碱注射液(江苏正大天晴药业有限公司，商品名天晴复欣)600g/100L 静脉滴注，每日1次，连用14d，如无不适以及化验正常，给予氧化苦参碱胶囊(江苏正大天晴药业有限公司，商品名天晴复欣胶囊)0.2g，每日3次，口服6周，总疗程共8周。健康对照组，来自我院健康职工，其中男5例，女5例，平均年龄(52.3±10.2)岁。

　　1.3 血清MMP9、TIMP1含量的检测 所有患者及对照组均于清晨空腹抽取肘静脉血6mL，其中2mL以2500×g离心3min分离血清，-20℃冻存待检。采用双抗体夹心ELISA法测定MMP9、TIMP1含量，试剂盒均为美国Biotec公司产品。余4mL分送血常规、肝功能及血尿素氮、肌酐等检查。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS12.0软件，所有数据均采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 实验完成情况 氧化苦参碱组入组20例，脱落3例；常规治疗组20例，脱落1例。

　　2.2 治疗8周后肾功能的变化 治疗前，常规治疗组和氧化苦参碱组肾功能比较无显著性差异(P>0.05)。治疗8周后，两组肾功能较前改善，但氧化苦参碱组肾功能改善较常规治疗组相对明显，但无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　表1 治疗前、后两组肾功能的比较（略）

　　Table 1 Renal function levels in conventional group and oxymatrine group before and after treatment

　　BUN: blood urea nitiogen; Scr: serum creatitine; GFR: glomerular filtration rate

　　2.3 治疗前、后两组血清MMP9、TIMP1水平的比较 治疗前，常规治疗组和氧化苦参碱组血清MMP9、TIMP1的含量分别为(94.35±63.22)μg/L、(1440.20±258.31)μg/L和(96.29±60.10)μg/L、(1454.49±261.27)μg/L，比较无显著性差异(P>0.05)。
　　
　　治疗8周后，常规治疗组血清MMP9水平显著下降(P<0.05)，TIMP1水平有所下降，但无显著性差异(P>0.05)；氧化苦参碱组TIMP1水平显著下降(P<0.05)，MMP9水平较治疗前无显著性差异(P>0.05)。与常规治疗组比较，经氧化苦参碱干预后，TIMP1水平显著下降(P<0.05)，MMP9水平显著高于常规治疗组(表2)。

　　表2 两组治疗前、治疗8周后血清MMP9、TIMP1水平的比较（略）

　　Table 2 MMP9 and TIMP1 levels in conventional group and oxymatrine group before and after treatment

　　*P<0.05 vs. before treatment

　　3 讨论
　　
　　肾间质纤维化是指由多种原因引起的ECM成分在肾间质内过度的沉积。积聚在肾间质的ECM成分复杂，既包括正常肾间质已有的基质蛋白成分，如Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和腱蛋白等的增多，还包括正常时仅存在于肾小管基底膜的基质蛋白，如Ⅳ型胶原等的沉积[5]。MMPs是一类含有锌离子、结构高度同源的内肽酶的总称，组成MMPs超家族。MMPs的合成、分泌及激活过程的各个环节都受到严密监控，一些细胞因子、生长因子及激素等能调节MMPs合成[1]，MMPs与TIMPs之间的平衡是ECM保持完整的前提条件。MMP9也称胶原酶或明胶酶B，主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原及纤维连接蛋白(FN)、纤溶酶原(PG)及弹性蛋白等，能降解完整的基底膜。大量研究表明，在IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等慢性肾脏病中，MMP9均有异常表达。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，是一组多基因家族的编码蛋白，目前有4种克隆构成TIMPs家族。TIMPs和MMPs一起相伴分泌至细胞外的微环境，由于TIMPs的抑制作用，MMPs的分泌和活化并不一定能降解靶器官的ECM。TIMP1是TIMPs家族中的典型代表，由巨噬细胞和结缔组织产生，以可溶性小分子量多肽的形式分泌，广泛存在于组织和体液中。其可与活化的MMPs以1∶1非共价键结合抑制MMPs对ECM的降解，也可与酶原结合阻止其活化，通过抑制MMPs的活性而阻断ECM的降解，从而引起细胞外基质的积聚。此外，TIMP1又叫促红细胞生长潜能因子，可以促进多种细胞的生长，被认为是血清中的生长因子[6]。Baricos[7]通过向体外培养的肾小球系膜细胞的培养上清液中加入重组的TIMP1，结果导致ECM降解减少33%。
　　
　　付平等[8]在苦参碱对单侧输尿管梗阻(UUO)模型肾间质纤维化影响的实验研究中发现，苦参碱可以部分恢复肾小管间质MMP3表达水平，降低TIMP1、FN的表达水平。动物实验发现，经氧化苦参碱干预后，UUO大鼠肾间质炎细胞浸润、增殖程度、胶原纤维表达明显减少，肾间质纤维化程度明显减轻[9]。
　　
　　目前，国内外尚无苦参碱治疗肾间质纤维化的临床报道。我们通过观察氧化苦参碱注射液对慢性肾脏病患者血清MMP9和TIMP1表达的影响，以寻求新型有效的、不良反应小的治疗药物。研究结果表明，氧化苦参碱注射液可以显著恢复MMP9的表达水平，降低TIMP1的表达水平，并且在整个研究过程中未出现明显的不良反应。由此，我们推测苦参碱可能通过一定程度地恢复肾间质MMP9的表达和降低TIMP1的表达，以此来调节MMPs/TIMPs之间的比值，增加ECM的降解，从而减少细胞外基质蛋白的沉积，减轻肾间质纤维化。氧化苦参碱已被证实可以减少αSMA、TGFβ、CTGF的表达[9]。因此，我们推测氧化苦参碱通过减弱ECM产生细胞的活化程度和降低致纤维化细胞因子TGFβ、CTGF的表达来调节ECM蛋白的合成和降解的速度，延缓间质纤维化。从临床疗效看，短期应用氧化苦参碱对慢性肾脏病有一定的治疗作用，其长期应用情况以及对于肾损害严重患者应用情况还有待进一步研究。
　　
　　目前，尚无检测肾间质纤维化的血清学指标，临床上一般依赖于有创伤性的经皮肾穿刺活检诊断。该法具有难以随访和难以动态观察的不足。ELISA法联合检测血清MMP9、TIMP1可能对判断肾脏疾病的进展具有重要意义，而且操作简便、快速，便于临床开展。

参考文献

　　[1]Nagase H， Visse R， Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs [J]. Cardiovascular Res， 2006， 69:562573.

　　[2]王俊学，王国俊. 苦参碱及氧化苦参碱的药理作用及临床应用 [J]. 肝脏， 2000， 5(2):116117.

　　[3]王海燕. 慢性肾脏病及透析的临床实践指南 [M]. 北京:人民卫生出版社，2003:67.

　　[4]杨霓芝，包昆，王立新. 通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究 [J]. 广州中医药大学学报， 2000， 17(4):332336.

　　[5]Eddy AA. Molecular insights into renal interstitial fibrosis [J]. J Am Soc Nephrol， 1996， 7(12):24952508.

　　[6]Hayakawa T， Yamashita K， Tanzawa K， et al. Growth promoting activity of tissue inhibitor of metalloproteinase1(TIMP1) for a wide range of cells [J]. FEBS Lett， 1992， 298:2932.

　　[7]Baricos WH， Crotez SL， elDahr SS， et al. ECM degradation by cultured human mesangial cells is mediated by a PA/plasmin/MMP2 cascade [J]. Kidney Int， 1995， 47(4):10391047.

　　[8]付平，冯梅，张翥，等. 苦参碱对UUO模型肾小管间质MMP3、TIMP1和FN影响的实验研究 [J]. 四川大学学报(医学版)， 2005， 36(6):816819.

　　[9]姚钢炼，宁宁，高登峰，等. 氧化苦参碱在大鼠肾间质纤维化进程中的保护作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2006， 27(3):254257.