作者：李宝莉，夏传涛，袁秉祥
【摘要】 目的 研究不同工艺(压榨与超临界CO2萃取)所得酸枣仁油对小鼠镇静、催眠作用的影响，并对两种工艺酸枣仁油的作用进行了等效性检验。方法 利用光电计数法观察灌胃给予酸枣仁油(1.8 g/kg、3.6 g/kg)对小鼠自主活动的影响，以及重复使用对小鼠自主活动耐受性的影响；利用戊巴比妥钠阈上剂量睡眠实验和阈下剂量睡眠诱导实验，观察两种工艺酸枣仁油(1.8 g/kg、3.6 g/kg)的催眠作用；用地西泮进行平行对照实验。结果 压榨与超临界CO2萃取的酸枣仁油均能减少小鼠的自主活动次数；缩短阈上剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠持续期；增加阈下剂量戊巴比妥钠引起的小鼠入睡例数。研究还表明，不同工艺提取的酸枣仁油对小鼠的镇静、催眠作用均具有等效性。重复使用酸枣仁油对小鼠自主活动的抑制作用随用药时间的延长而增强，无耐受现象。结论 两种工艺所得酸枣仁油具有等效的镇静、催眠作用，重复使用无耐受现象。
【关键词】 压榨；超临界CO2萃取；酸枣仁油；镇静；催眠；等效性检验
ABSTRACT: Objective To study the sedative and hypnotic effects of oil of spine date seeds by different extraction technologies (compression and supercritical CO2 extraction， OSDSE and OSDSS) in mice. Equivalence test was used to test the effects. Methods Spontaneous activity and tolerance were observed by photoelectric counting method after long-term intragastric administration of OSDSE and OSDSS in mice. The sleeping time and delitescence induced by above threshold dose of pentobarbital sodium and sleeping number induced by below threshold dose of pentobarbital sodium were utilized to observe the hypnotic effect of OSDSE and OSDSS in mice. Diazepam was applied as a positive control drug. Results OSDSE and OSDSS could obviously reduce spontaneous activity， increase sleeping time and sleeping number in mice， while the sleeping delitescence was shortened. All the effects induced by OSDSE and OSDSS were equivalent. The inhibitory effect of spontaneous activity was enhanced following repeated administration， while the effect of diazepam was reduced. Conclusion Both oils of spine date seeds can induce sedative and hypnotic effects without tolerance. They have equivalent effects on sedation and hypnosis.
KEY WORDS: compression; supercritical CO2 extraction; oil of spine date seed; sedative effect; hypnotic effect; equivalence test
酸枣仁为鼠李科落叶灌木或乔木植物酸枣仁［ziziphus jujube Mill.var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou］的干燥成熟种子。酸枣仁味甘、酸，性平，能养心益肝、安神敛汗。主要用于心肝血虚之心悸、失眠；体虚之自汗、盗汗。一般认为，酸枣仁的中枢抑制作用是酸枣仁皂苷等水溶性部分所致。已有报道发现压榨酸枣仁油也具有一定的镇静催眠作用［1］。不同工艺提取的酸枣仁油对小鼠中枢神经活动的影响是否一致，该作用是否具有耐受性，均未见报道。本文观察了压榨和超临界CO2萃取的酸枣仁油对小鼠镇静、催眠作用的影响，并进行了等效性分析。
1 材料与统计
1.1 药品
压榨的酸枣仁油(oil of spine date seeds of compression， OSDSE)由陕西省油脂化工研究所提供，超临界CO2萃取(简称萃取)的酸枣仁油(oil of spine date seeds of supercritical CO2 extraction， OSDSS)由第四军医大学药物研究所制备；地西泮(diazepam)注射液由上海旭东海普药业有限公司生产，批号041001，与生理盐水配成1 g/L水溶液备用；戊巴比妥钠(pentobarbital sodium)为Sigma公司产品，上海化学试剂公司分装，批号：F20030816。
1.2 仪器
FY221-50-06型超临界萃取装置(南通市飞宇石油科技开发有限公司产品)；YLS-1A小鼠自主活动记录仪(山东省医学科学院设备站提供)。
1.3 动物
健康ICR封闭群小鼠，二级合格动物，合格证号：陕医动字08-004；体重18-22 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.4 统计学处理
实验数据以±s表示。显著性检验采用SPSS13.0统计分析软件，多组间比较用方差分析及LSD-t检验，两组间比较用双侧t检验，P<0.05为具有统计学意义；两种工艺酸枣仁油同剂量组进行等效性检验，采用DAS ver1.0(Drug and Statistics for Windows)统计分析软件的两药实测值等效性分析模块，采用双向单侧t检验进行等效性分析；对质反应资料，如阈下催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠例数实验采用两组有效率分析模块，用Fisher精确概率法进行两组比较，以5%为等效标准，P<0.05为等效性合格［2］。
2 方法与结果
2.1 压榨和萃取的酸枣仁油对小鼠自主活动的影响
取108只小鼠均衡随机分为6组，每组18只，♀、♂各半，分组如下：2 mg/kg地西泮阳性对照组、压榨的酸枣仁油组和萃取的酸枣仁油组1.8 g/kg小剂量组、3.6 g/kg大剂量组、正常组给予等剂量生理盐水(NS)，灌胃，每日2次，连续3 d。测试前禁食12 h，第4天早9:00时开始灌胃60 min后，用YLS-1A小鼠自主活动记录仪记录各组小鼠30 min的自主活动次数。结果显示，萃取与压榨酸枣仁油可减少小鼠自主活动次数，各剂量组与生理盐水组相比均有显著性意义；两种工艺酸枣仁油同剂量组之间无统计学意义，等效性检验合格。说明萃取与压榨酸枣仁油均具有镇静作用，且镇静作用具有等效性(表1)。表1 压榨与萃取酸枣仁油对小鼠自主活动的影响（略）
2.2 压榨和萃取的酸枣仁油对阈上催眠剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠作用的影响
取小鼠120只，♀、♂各半，均衡随机分为6组，每组20只，给药组分别按小剂量组1.8 g/kg、大剂量组3.6 g/kg给予压榨的酸枣仁油和萃取的酸枣仁油，阳性对照组给予2 mg/kg地西泮，正常组给予等剂量生理盐水，灌胃。1 h后，均腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg，以翻正反射消失时间、睡眠持续时间为指标，记录各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续期。表2 压榨与萃取酸枣仁油对阈上戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期的影响（略）
与生理盐水组相比，地西泮、萃取与压榨酸枣仁油均可缩短阈上剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期(表2)和延长睡眠持续时间(表3)；两种工艺酸枣仁油同剂量组之间无统计学意义，等效性检验合格。说明萃取与压榨酸枣仁油均具有一定的催眠作用，但二者作用的差异无显著性意义，且发挥等效性催眠作用。表3 压榨与萃取酸枣仁油对阈上戊巴比妥钠小鼠睡眠时间的影响（略）
2.3 压榨和萃取的酸枣仁油对阈下剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠诱导作用的影响
取小鼠240只，随机分为6组，每组40只，给药组分别按小剂量组3.6 g/kg、大剂量组5.4 g/kg给予压榨的酸枣仁油和超临界CO2萃取的酸枣仁油，阳性对照组给予4 mg/kg地西泮，正常组给予等剂量生理盐水，灌胃。1 h后，均腹腔注射戊巴比妥钠25 mg/kg，以小鼠翻正反射消失为指标，记录各组小鼠15 min内的睡眠数。
各组与生理盐水组相比，萃取与压榨酸枣仁油可增加阈下剂量戊巴比妥钠引起的小鼠入睡例数；两种工艺提取的酸枣仁油大剂量组比较，显示无统计学意义，且等效性合格。研究说明，萃取与压榨酸枣仁油均具有催眠作用，且作用具有等效性(表4)。表4 压榨与萃取酸枣仁油对阈下戊巴比妥钠小鼠睡眠例数的影响（略）
2.4 重复使用萃取的酸枣仁油对小鼠自主活动的影响
取♀小鼠40只，随机分为4组，酸枣仁油大3.6 g/kg、 小1.8 g/kg剂量组，地西泮3 mg/kg阳性对照组，正常组给予等体积的生理盐水，每日2次，连续给药15 d。在第1天、第3天、第5天、第15天上午9：00时开始给药，60 min后，用YLS-1A小鼠自主活动记录仪依次记录各组小鼠30min的自主活动次数，并观察重复给药后，药物镇静作用的耐受现象。
与生理盐水组比较，地西泮组随用药时间的延长抑制小鼠自主活动的作用逐渐减弱；而萃取的酸枣仁油随用药时间的延长抑制作用逐渐加强，未表现出药物耐受性(表5)。表5 萃取的酸枣仁油重复使用对小鼠自主活动的影响（略）
3 讨 论
由以上结果可知：酸枣仁油可使小鼠的自主活动次数减少；缩短小鼠睡眠潜伏期，延长睡眠持续期；增加小鼠入睡数。因此，该实验证明了酸枣仁油具有镇静、催眠作用［3］。研究还表明，不同提取工艺(压榨和超临界CO2萃取)的酸枣仁油抑制小鼠的自主活动、缩短睡眠潜伏期、延长睡眠持续期及大剂量增加入睡数的作用均具有等效性。重复使用酸枣仁油对小鼠自主活动的抑制作用随用药时间的延长而增强，无耐受现象。
近年来的研究表明，超临界CO2萃取的酸枣仁油主要含油酸、亚油酸等［4］。亚油酸(LA)在体内可转化成γ-亚麻酸、花生四烯酸、前列腺素(PG)、前列环素、血栓素、脂毒素及白三烯(LTs)等［5］。亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸等游离脂肪酸通过GPR40受体的介导促进胰岛素(In)的分泌［6］。LTB4、LTD4可刺激外周血单核细胞和T细胞产生IL-1、TNF-α。油酸可在体内酰化生成内源性睡眠诱导物——油酰胺(OLA)。已知PG2、IL-1、TNF-α、Ins、OLA等为内源性睡眠诱导物，PG2、IL-1、TNF-α等能促进不同种属的动物的非快眼动睡眠，INs、OLA等具有调节慢波睡眠，诱导生理性睡眠的作用［7］。镇静、催眠的其他机制尚待研究。
一般认为，酸枣仁皂苷、黄酮等水溶性部分是酸枣仁镇静、催眠作用的有效部位［8-9］，但本研究表明，酸枣仁油才是酸枣仁发挥镇静、催眠作用的有效部位。按生药量计算，酸枣仁油产生镇静、催眠作用的生药剂量是10-20 g；而酸枣仁皂苷等的生药剂量相当于酸枣仁油的几百倍，可见酸枣仁油才是酸枣仁的有效部位。
参考文献
［1］吴尚霖，袁秉祥，马志义. 酸枣仁油长期使用对小鼠催眠作用的影响 ［J］. 西北药学杂志， 2001， 16(3):114-115.
［2］朱芳，袁秉祥. 生物等效性检验的计算及计算程序 ［J］. 西安交通大学学报(医学版)， 2001， 22(2):164-166.
［3］赵启铎. 酸枣仁油中不饱和脂肪酸的药理实验研究 ［J］. 天津中医药， 2005， 22(40):331-333.
［4］陈振德，许重远，谢立.超临界流体CO2萃取酸枣仁脂肪油化学成分的研究 ［J］. 中草药，2001， 32(11):976-977.
［5］张庭延，高留英. 必需脂肪酸的生理病理意义 ［J］. 国外医学生理、病理科学与临床分册， 1998， 18(2):180-151.
［6］Itoh Y， Kawamata Y， Harada M， et al. Free fatty acids regulate indulin secretion from pancreatic β cell through GPR40 ［J］. Nature， 2003， 422:173-176.
［7］苏定冯，缪朝玉，王佑铭. 2004药理学进展 ［M］. 北京：人民卫生出版社，2004：305-312.
［8］郭胜民，范晓雯，何建伟. 酸枣仁总黄酮的中枢抑制作用 ［J］. 中药材， 1998，21(11):578.
［9］陈百泉，杜钢军，许启泰. 酸枣仁皂苷的镇静催眠作用 ［J］. 中药材， 2002，25(6):429-430.