远程氩等离子体对医用聚四氟乙烯表面灭菌与改性的研究

【摘要】 目的 研究远程氩等离子体对医用聚四氟乙烯(PTFE)表面的灭菌及改性。方法 通过载体定量灭菌实验测定远程氩等离子体对PTFE表面大肠杆菌的杀灭效果，并利用接触角测量、质量损失率计算和X射线光电子能谱分析(XPS)研究灭菌前后PTFE表面结构、性能的变化。结果 在放电功率100W，放电时间120s，氩气流量20cm3/min的条件下，远程及常规氩等离子体均可有效灭活大肠杆菌(GE≥3.769)；但经远程氩等离子体灭菌后，PTFE表面的亲水性(水接触角为58.5°)明显优于常规氩等离子体灭菌后的PTFE表面(水接触角为70.5°)，同时受损及降解程度低(表面质量损失率仅为11.8%)。远程氩等离子体可以在一定程度上抑制电子、离子的刻蚀作用，强化自由基反应，对PTFE表面的脱氟作用更强，从而引入更多的含氧基团。结论 远程氩等离子体在有效杀灭大肠杆菌的同时，可使PTFE表面获得更好的改性效果。

【关键词】 远程氩等离子体；大肠杆菌；灭菌；PTFE；表面改性

　　ABSTRACT: Objective To investigate the surface sterilization and modification of medical poly (tetrafluoroethylene) (PTFE) by remote argon plasma. Methods Carrier quantitative bactericidal test was used to examine the germicidal effect (GE) of the E.coli on the surface of medical PTFE film and surface structure， performances of sterilized PTFE were characterized by the water contact angle， mass loss and Xray photoelectron spectroscopy (XPS). Results Both remote and conventional argon plasmas could sterilize effectively(GE≥3.769) in the conditions of plasma RF power 100W， exposure time 120s and argon flux 20cm3/min. Remote argon plasma sterilization made the PTFE surface have higher hydrophilicity (θ=58.5°) than the conventional argon plasma sterilization (θ=70.5°) and did not cause remarkable degradation and damages in terms of the mass loss (mass loss was 11.8%). Remote argon plasma sterilization could enhance interaction reactions with argon radicals relative to those with electron and argon ions， thereby contributing more effectively to defluorination (F/C=2.24) from the PTFE than the conventional argon plasma sterilization (F/C=2.49) and more effectively to the formation of oxygen functionalities on the PTFE surface. Conclusion Remote argon plasma can inactivate E.coli effectively and at the same time bring better surface modification of PTFE.

　　KEY WORDS: remote argon plasma; Escherichia coli; sterilization; poly (tetrafluoroethylene) (PTFE); surface modification

　　医学灭菌较之其他技术更强调稳定性、安全性。因此，低温等离子体灭菌以其能够克服传统方法使用中的缺陷，具备快速、低温、干式无污染等特点，实现了灭菌技术的“绿色化”，被认为是新一代最有前途的灭菌技术[12]。但在等离子体作用于微生物的同时，也必然作用于染菌载体表面。随着越来越多的聚合物材料被广泛应用于现代医用设备、生物移植材料中，等离子体在灭菌的同时引发这些医用高分子材料表面的化学修饰、刻蚀、交联、聚合等反应[3]会对其医学使用性能有何影响，越来越受到人们的关注。一般的等离子体灭菌研究都只限于在放电区进行，即放电过程中生成的各活性物种(电子、离子、自由基等)混合存在，同时作用[12，45]，此时，材料表面的改性是难以控制的[6]。究竟能否实现灭菌与材料表面性能最优化的同步完成，从而实现可控等离子体灭菌技术，是等离子体灭菌应用基础研究中亟待解决的问题，尚未见国内外报道。据此，我们利用远程等离子体灭菌技术，强化目的性反应，从而实现灭菌与材料表面改性的同步完成。
　　
　　本文考察了远程氩等离子体对医用聚四氟乙烯[poly (tetrafluoroethylene)， PTFE]表面大肠杆菌的灭活作用，并在特定的等离子体灭菌条件下，通过接触角测定、质量损失率测定和X射线光电子能谱(Xray photoelectron spectroscopy， XPS)分析研究了灭菌前后PTFE表面结构、性能的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 医用PTFE膜为阜新氟化学有限责任公司制造，样本尺寸50mm×25mm，厚度20μm。大肠杆菌(Escherichia coli， ATCC 8099)为本实验室保存菌种。营养琼脂为北京奥博星生物技术责任有限公司产品。

　　1.2 实验装置 自行研制的远程等离子体反应器如图1所示。它由进气系统、反应室、抽气系统和射频电源及电极四部分组成。射频电源为SY500W型晶控射频功率源，频率13.56MHz，输出功率连续可调，与SPⅡ型射频匹配器配合。采用电感耦合放电方式，通过调整电感耦合可使电源反射功率接近于0。反应室为长1m、直径45mm的硬质玻璃管，在感应线圈处放电，在准理想管式反应器中，等离子体沿一维方向向远端扩散，形成远程等离子体。

　　图1 远程等离子体反应器结构示意图（略）

　　Fig.1 Schematic structure of remote plasma reactor

　　1: Gas bottle; 2: Valve; 3: Mass flow meter; 4: Inductance coil; 5: Matching system; 6: RF generator; 7: Sample; 8: Reaction chamber; 9: Vacuum gauge; 10: Electromagnetism valve; 11: Vacuum pump; 12: Grounding protection

　　1.3 方法
　　
　　1.3.1 载体定量灭菌实验 冻干菌种融化后，复苏划线接种于营养琼脂(北京奥博星生物技术责任有限公司产品)培养基平板，挑取典型单菌落，接种斜面37℃培养过夜。将此菌苔用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution， PBS)振荡洗脱，稀释配成适宜浓度的菌悬液，取0.01mL均匀涂于医用PTFE膜表面，晾干备用[7]。实验时，将染菌样片置于等离子体场中距电感线圈中点不同距离处的载物板上，在不同放电功率、处理时间、氩气流量(氩气纯度优于99.99%)条件下进行处理。处理后的样片(阳性对照不经处理)放入PBS溶液中，再经充分振荡洗脱，稀释配成适宜浓度的菌悬液，取样进行活菌培养计数。灭菌效果(germicidal effect，GE)按下式计算[7] ：
　　
　　GE=lgN0-lgNt

　　式中，N0为阳性对照组样品生长菌落数(cfu)；Nt为实验组样品生长菌落数(cfu)。每组实验均重复三次，取平均值代入上式。
　　
　　PTFE样片从菌悬液中取出后，用去离子水反复清洗，自然晾干，用于表面改性各项指标的测试分析。

　　1.3.2 接触角测试 采用接触角测定仪(JY82型，承德试验机厂制造) 立即对灭菌后洗净干燥的PTFE样片进行水接触角测量。温度为(20±1)℃，湿度(45±5)%R.H.，液滴(去离子水)经微量进样器排出，液量控制以液滴与试样接触面直径2-3mm为宜。液体在各试样的接触角测量点为10个，数据取平均值。

　　1.3.3 质量损失率测试 采用电子分析天平(Mettler AE240型)测量灭菌前后PTFE样片的质量，按下式计算样片的质量损失率(ML)[8]：
　　
　　ML=M0-MtM0×100%

　　式中，M0、Mt分别为灭菌前后样片的质量(μg)。

　　1.3.4 X射线光电子能谱分析 灭菌前后PTFE样片表面的化学成分通过XPS (PHI5400ESCA，美国PerkinElmer 公司制造)分析，以MgKα为X射线源(扫描范围0-1253.6eV)，功率250W，通能235eV，分析室真空度50nPa，分析仪器与样片之间的掠射角为90°。

　　2 结果

　　2.1 远程氩等离子体处理条件对灭菌效果的影响

　　2.1.1 放电功率对灭菌效果的影响 无论试样距放电区距离多少(图2)，随着功率的增加，GE值均呈波动式变化，在功率达到80W后，迅速增加。这是由于功率增大至80W后，定量氩气分子获得的能量迅速增加，则氩气的电离度以及活性粒子的平均能量增高，使得活性粒子与细菌的作用几率和强度增强，从而使灭菌效果显著提高。实验确定，远程氩等离子体的最佳灭菌功率为100W。

　　图2 放电功率对大肠杆菌杀灭效果的影响（略）

　　Fig.2 Effect of RF power on germicidal effect at different sample positions

　　(treatment time: 120s; argon flux: 20cm3/min)

　　2.1.2 处理时间对灭菌效果的影响 无论试样距放电区距离多少(图3)，随着放电时间的增加，GE值先减小，30s后迅速增大。这是由于在射频氩等离子体场中，具有高质量、低流速的Ar+和快原子需要经历25-30个射频周期才能达到稳定，这期间低质量的电子则呈波动式的变化。因此，放电初始各种粒子均呈非稳态[9]。与此同时，部分高能态的电子转化为亚稳态，引起电子温度下降而造成电子扩散速率减慢[10]，不能有效轰击细菌细胞，且此时反应也是随机的。放电时间达30s后，氩活性粒子达到稳定，与大肠杆菌细胞碰撞的几率和强度增加，灭菌效果随之增加。实验确定，远程氩等离子体的最佳灭菌时间为120s。

　　图3 处理时间对大肠杆菌杀灭效果的影响（略）

　　Fig.3 Effect of plasma treatment time on germicidal effect at different sample positions

　　(power: 100W; argon flux: 20cm3/min)

　　2.1.3 氩气流量对灭菌效果的影响 无论试样距放电区距离多少(图4)，灭菌效果均随气体流量的增大而降低。这是由于当随着气体流量的增大，氩原子的密度虽然同步提高，但电子的平均自由程变小。由于维持功率不变，放电区的射频磁场和电场强度基本不变。因此，等离子体的电离度随气体流量的增大而下降，使得活性粒子与大肠杆菌的有效碰撞几率和强度减弱，从而使灭菌效果持续下降。综合考虑各实验条件确定，远程氩等离子体灭菌的适宜气体流量为20cm3/min。

　　图4 氩气流量对大肠杆菌杀灭效果的影响（略）
　　
　　Fig.4 Effect of argon flux on germicidal effect at different sample positions

　　(power: 100W; treatment time: 120s)

　　2.1.4 远程距离对灭菌效果的影响 在最佳灭菌条件下，灭菌效果随远程距离变化的曲线如图5所示。由图可知，在距放电区0、20、40、60、80cm处，GE值分别可达4.633、4.192、3.769、2.579和2.042。这意味着在远程40cm内，氩等离子体都能有效灭活医用PTFE表面的大肠杆菌。

　　图5 试样距放电区距离对大肠杆菌杀灭效果的影响（略）

　　Fig.5 Effect of sample position on germicidal effect

　　(power: 100W; treatment time: 120s; argon flux: 20cm3/min)

　　2.2 远程氩等离子体灭菌对医用PTFE表面性能的影响

　　2.2.1 PTFE表面亲水性的变化 经远程氩等离子体灭菌后PTFE表面水接触角θ随远程距离变化的曲线如图6所示。由图可知，在最佳等离子体灭菌条件下，随着试样距放电区距离的增加，接触角先减小，由灭菌前的108°降低到40cm处的58.5°，达到最低，后又略有反弹。这是因为放电区电子、离子的刻蚀作用强烈，自由基浓度相对较低，远程区刻蚀作用得到抑制，自由基反应得到强化[6]，使得表面引进了更多的极性基团，增加了材料的表面极性。实验表明，远程40cm处PTFE表面润湿性得到最大改善。

　　图6 试样距放电区距离对接触角的影响（略）

　　Fig.6 Effect of sample position on the contact angle to water of PTFE film

　　(power: 100W; treatment time: 120s; argon flux: 20cm3/min)

　　2.2.2 PTFE表面质量损失率的变化 图7是经远程氩等离子体灭菌后PTFE表面质量损失率随远程距离变化的曲线。由图可知，在最佳等离子体灭菌条件下，PTFE表面质量损失率随试样距放电区距离的增加快速下降，由0cm处的35%降至40cm处的11.8%和80cm处的5.9%。这同样是由于放电区电子、离子的强烈刻蚀作用和远程区自由基反应的强化使得试样距放电区距离越远，刻蚀越弱。由于远程60cm和80cm处的灭菌效果较差。因此，实验确定，远程40cm处的灭菌可使PTFE表面的受损及降解程度降至最低。

　　图7 试样距放电区距离对质量损失率的影响（略）

　　Fig.7 Effect of sample position on mass loss of PTFE film

　　(power: 100W; treatment time: 120s; argon flux: 20cm3/min)

　　2.2.3 PTFE表面X射线光电子能谱的分析 图8为最佳等离子体灭菌条件下灭菌前后不同距离处的PTFE表面C1s谱图的分峰解析。如图所示，PTFE的C1s峰可分解为5个峰的叠加，分别是CHFCh3和C=O(287.6-87.9eV)，CH(OR)CHF(289.6-289.8eV)，Ch3CHF(285.9-296.0eV)，CF2CF2(292.5eV)，CF3CF2和CF(OR)2CF2(293.7-294.1eV)。灭菌后PTFE表面碳的结构与组成均发生了明显的变化。
　　
　　XPS的定量分析结果见表1。由表可知，经氩等离子体灭菌后，样片表面F/C有明显的下降，并且远程40cm处得到更低的F/C，说明试样距放电区距离的增加有助于增强氩等离子体脱去PTFE表面氟原子的能力。这是远程区增强自由基反应的结果。
　　
　　O/C的增加幅度较小及氧元素的结构、组成变化不明显，但也从未处理前的0.02上升至0.09。这种数值上的改变反映了PTFE经氩等离子体处理后与空气中的氧发生了后续反应：即氩等离子体照射PTFE表面时，由于氩电子、离子的轰击，CF和CC键断裂，生成的碳自由基与空气中的氧结合，形成永久性的亲水性基团COOH，使亲水性得到改善。这种后续反应在40cm处灭菌后的PTFE表面更为强烈。

　　图8 远程氩等离子体灭菌前后PTFE表面C1s谱图的分峰解析（略）

　　Fig.8 C1s spectra of XPS analysis A: unsterilized PTFE film; B: 0cm; C: 40cm

　　(power: 100W; treatment time: 120s; argon flux: 20cm3/min)
　　
　　表1 远程氩等离子体灭菌前后PTFE的表面原子组成（略）

　　Table 1 Atomic composition of argon plasma sterilized PTFE film

　　3 讨论
　　
　　等离子体放电空间中存在大量的活性粒子，它们中的一部分在与细菌作用的同时，会和PTFE 的表面发生反应，打开表面的化学键。打开的化学键重新组合使得表面发生刻蚀(交联) ，或和等离子体中的反应粒子相互作用，在表面引入一些新的基团，提高表面性能。本文采用远程氩等离子体表面灭菌技术，即利用等离子体中各种活性粒子(电子、离子、自由基) 的存活寿命不同的特点(电子离子、自由基自由基再结合的速率常数分别为10-7cm3/s和10-33cm6/s[11])，在特定的等离子体场中使它们分离，形成较纯的高浓度自由基氛围，实现可控等离子体灭菌，强化目的性反应。本文的实验结果表明，与常规氩等离子体相比(0cm)，远程氩等离子体(40cm)可有效抑制电子、离子的刻蚀作用，增强自由基反应，在有效完成灭菌的同时，对PTFE表面的脱氟作用更强，引入更多的含氧基团，从而使得表面亲水性更好，并且材料的受损及降解程度最低。远程氩等离子体获得的较纯高浓度自由基可使医用PTFE表面的灭菌和改性同步完成。

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