西安地区青少年骨密度值及其与维生素D受体基因多态性的研究

【摘要】 目的 提供西安地区9-12岁青少年腰椎骨密度(BMD)的正常参考值，研究维生素D受体基因(VDR)多态性与9-12岁青少年BMD的关系。方法 收集排除影响骨代谢疾病的西安地区9-12岁汉族儿童200例，进行问卷调查、体格测量；用双能X线骨密度仪(DEXA)测量腰椎BMD；用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法(PCRRFLPs)，分析VDR基因的2个限制性酶切位点BsmⅠ、FokⅠ的多态性分布。结果 ①各组青少年腰椎BMD值均随年龄增长而逐渐增高，且与年龄呈显著正相关(P<0.001)。9-10岁男、女性之间BMD无明显差异(P>0.05)，11岁以后女性BMD高于男性(P<0.05)；②各组青少年身高(P<0.001，r=0.418-0.582)、体重(P<0.05，r=0.627-0.816)与BMD均呈明显正相关；③ff基因型BMD低于Ff与FF基因型，分别为(0.631±0.064)g/cm2、(0.654±0.012)g/cm2和(0.689±0.058)g/cm2，差异有统计学意义(F=9.24，P<0.05)。结论 VDR基因在FokⅠ酶切位点的多态性与9-12岁汉族青少年BMD相关。

【关键词】 骨密度；基因多态性；维生素D受体；青少年

　　ABSTRACT: Objective To observe the bone mineral density (BMD) of Han 9-12 children aged from 9 to 12 years old in Xian， and the relation between vitamin D receptor gene polymorphism and bone mineral density. Methods Totally 200 cases of 9-12 yearold Han children without bone metabolism diseases were randomly selected. Questionnaire investigation and physical measurement of height and weight were made. BMD was measured by dual energy X ray absorptiometry. VDR gene polymorphism (cleavaged by restriction endonuclease of BsmⅠ and FokⅠ) was analyzed by PCRRFLP. Results ① BMD in lumbus was increased with age for both genders， and a positive correlation between bone mass and age was observed (P<0.001). There was no significant difference in BMD of children between females and males under 11 years old， but females had a higher BMD than males between the ages of 11 and 12 years (P<0.05); ② BMD in lumbus was significantly correlated with height (P<0.001， r=0.418-0.582) and weight (P<0.05， r=0.627-0.816); ③ BMD of the ff genotype (0.631±0.064) was lower than that of genotype Ff (0.654±0.012) and genotype FF (0.689±0.058) with a significant difference (P<0.001). Conclusion The VDR gene polymorphism in the site cleavaged by restriction endonuclease of FokⅠ is related to BMD of Han children aged 9-12 years.

　　KEY WORDS: bone mineral density; gene polymorphism; vitamin D receptor; children

　　骨密度(bone mineral density， BMD)是决定骨强度的主要因素之一，能够预测骨折的发生率。它受年龄、性别、遗传、营养状况、雌激素水平等的影响，其中遗传因素是BMD的主要影响因素。确认影响BMD的遗传因素，对于阐明骨质疏松症病理生理机制以及早期预测骨质疏松发病的危险因素具有重要意义。本研究检测了我国西安地区9-12岁汉族青少年BMD以及维生素D受体基因(vitamin D receptor， VDR)BsmⅠ、FokⅠ 2个等位基因型的分布频率，探讨VDR基因多态性与9-12岁汉族青少年BMD的关系。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 随机抽取2003年7月至2005年7月在我院门诊就诊的9-12岁青少年200名(男100名，女100名)，询问疾病史和家族史，并进行体格检查排除影响骨代谢疾病。其中满9周岁不满10周岁归为9岁年龄组(男25名，女25名)，满10周岁不满11周岁归为10岁年龄组(男25名，女25名)，以此类推。为了排除雌激素对BMD的影响，故要求女性研究对象为尚未有月经初潮者。

　　1.2 方法

　　1.2.1 问卷调查 主要内容包括年龄、性别、民族、有否骨折病史和长期服用影响骨代谢的药物等。由专人按照方案设计要求，询问家长。

　　1.2.2 身高、体重的测量 使用专用身高体重测量仪，按文献[1]的要求测量。

　　1.2.3 BMD的测定 采用美国Hologic公司生产的HologicQDR 2000型双能量X线骨密度仪(DEXA Dual Energy Xray Absorptiometry)。为保证机器扫描的质量，应用HologicQDR 2000型自动内部质量保证和控制系统进行工作，精密度为0.4%。由专职测量员测量第2-4腰椎正位骨密度，准确定位后，开始扫描，由微机自动分析并打印结果。

　　1.2.4 VDR等位基因的测定 取1mL新鲜静脉血，用申博公司提供的基因组DNA抽提试剂盒抽提外周血白细胞中DNA。设计特异性的引物2对[2]，见表1。
　　
　　分别按照下列条件进行PCR反应：基因组DNA 200ng、dNTP 200μmol/L、MgCl2 1.5mmol/L、引物0.5μmol/L、Taq plus(Taq+Pfu)DNA聚合酶2.5u和1×Taq plusDNA聚合酶缓冲液，加水至终体积50μL；PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性40s，分别68℃、58℃、60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃延伸7min。同时设阴性对照。分别用限制性内切酶BsmⅠ、FokⅠ进行酶切。BsmⅠ酶切产物用20g/L的琼脂糖胶电泳，FokⅠ酶切产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳。于ZFA2型紫外透射分析仪下观察酶切结果。

　　表1 VDR多态性分析所用引物（略）

　　Table 1 Primers of VDR gene polymorphism

　　1.2.5 统计方法 用SPSS 10.0 for Windows软件，采用多协变量方差分析和t检验。检验水准α=0.05(双侧)。

　　2 结果

　　2.1 9-12岁青少年的身高、体重和腰椎BMD的测量结果 见表2。200例青少年腰椎BMD值均随年龄增长而逐渐增高，且与年龄呈显著正相关(相关系数r分别为：男性0.80、女性0.70，P<0.001)。9-10岁男女性之间BMD无明显差异(P>0.05)，11岁以后女性BMD高于男性(P<0.05)。9-12岁男、女性青少年身高与BMD均呈明显正相关(P<0.001，r=0.418-0.582)，各年龄组男女性体重与BMD始终呈显著性正相关(P<0.05，r=0.627-0.816)。

　　表2 9-12岁青少年的身高、体重和腰椎BMD的测量结果（略）

　　Table 2 The height， weight and BMD in lumbus of children aged from 9 to 12 years old

　　2.2 PCR结果和酶切结果 以基因组DNA为模板，经PCR扩增，VDR基因产物为265bp和800bp。用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法(PCRRFLPs)法确定VDR基因FokⅠ酶切位点多态性为：Ff基因型(终产物为有265bp、169bp、96bp三条带)，ff基因型(终产物为有169bp、96bp二条带)，FF基因型(终产物为有265bp一条带)。VDR基因BsmⅠ酶切位点多态性为：bb基因型(终产物为有650bp、150bp二条带)，BB基因型(终产物为800bp一条带)，Bb基因型(终产物为有650bp、150bp、800bp三条带)(图1)。

　　图1 酶切结果图示（略）

　　Fig.1 Genotypes of VDR SCP by PCRRFLP

　　A: BsmⅠ， 1: Bb(800， 650， 150bp); 2: bb(650， 150bp); 3: BB(800bp); M: marker; B: Fok， 1: Ff(265， 196， 69bp); 2: ff(196， 69bp); 3: FF(265bp); M: marker

　　2.3 VDR基因型以及与BMD的关系 VDR基因FokⅠ酶切位点等位基因型与BMD相关，FF型118例(59%)，Ff型60例(30%)，ff型22例(11%)。3组基因型BMD的平均值为FF型：(0.689±0.058)g/cm2，Ff型：(0.654±0.012)g/cm2，ff型：(0.631±0.064)g/cm2。经统计学分析发现FokⅠ酶切位点等位基因VDR三种基因型之间的BMD的差异有统计学意义(F=9.24，P<0.05)。VDR基因BsmⅠ酶切位点等位基因型与BMD无关，Bb型170例(85%)，bb型12例(6%)，BB型18例(9%)。3组基因型BMD的平均值为Bb型：(0.675±0.028)g/cm2，bb型:(0.664±0.069)g/cm2，BB型：(0.671±0.017)g/cm2。经统计学分析发现在BsmⅠ酶切位点，不同等位基因型的BMD无差异(F=1.73， P>0.05)。

　　3 讨论
　　
　　骨量峰值(peak bone mass， PBM)代表个体一生中所能达到的最大BMD值或骨矿含量值(bone mineral content， BMC)，骨量峰值的高低与原发性骨质疏松症发生密切相关。目前研究表明，提高儿童、青少年时期所积累的骨量使PBM达到最高可有效预防原发性骨质疏松症的发生[3]。本研究采用双能X线骨密度仪(DEXA)测量西安地区9-12岁青少年腰椎骨密度，建立西安地区9-12岁青少年骨矿含量的正常参考值：9-12岁女性骨矿含量分别为(0.593±0.035)、(0.632±0.041)、(0.687±0.029)和(0.748±0.062)g/cm2；男性骨矿含量分别为(0.616±0.027)、(0.640±0.018)、(0.651±0.003)和(0.707±0.020)g/cm2。各组青少年腰椎BMD值均随年龄增长而逐渐增高，且与年龄、身高、体重呈正相关。9-10岁男、女性之间BMD无明显差异，11岁以后女性BMD高于男性。
　　
　　既往研究提示[4]女性BMD增长的关键时期在14岁以前，至14岁时其全身总的BMD值已达成人平均BMD值的90%。男性BMD增长的关键时期在16岁以前，至16岁时其全身总的BMD值约为成人平均BMD值的95%。在BMD增长的过程中出现两次BMD增长突增期，且女性加速时间较早，即女性BMD突增期为11岁和14岁，男性BMD突增期为12岁时和15岁。该观点在本研究中得到进一步证实，女性11岁以后骨矿含量高于男性。因此，在青少年时期，特别是突增期前后，应增加钙的摄入，保证将来能有较高的骨峰值。同时，本研究还显示身高、体重与腰椎BMD呈明显正相关，与有关文献报道一致[5]，在青少年时期，男女应维持一定的、合适的体重，以获得较高的骨峰值。
　　
　　本研究发现VDR基因FokⅠ酶切位点多态性与BMD相关，与国外研究结果相似[6]。VDR基因多态性影响BMD的机制尚不清楚。Gross等[7]研究发现由于F型VDR基因5′端的ATG突变为ACG，当f型VDR基因从第一位起始密码子ATG开始转录时，F型VDR基因却从下游6个核苷酸后存在ATG起始密码子开始转录。因此，F位点的VDR蛋白质较f位点短3个氨基酸长度，故与配体亲和力、mRNA的稳定性和转运的活力较f位点高，从而增加肠道对钙的吸收而增加BMD，具体机制有待进一步深入研究。
　　
　　通过本研究为西安地区9-12岁青少年骨矿含量提供了正常参考值，并初步探讨VDR基因BsmⅠ、FokⅠ酶切位点多态性与青少年BMD的关系。其他VDR基因酶切位点多态性与青少年BMD的关系及其相关机制有待进一步研究。

参考文献

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　　[7]Gross C， Krishnan AV， Malloy PJ， et al. The vitamin D receptor gene start codon polymorphism: A functional analysis of FokI variants [J]. J Bone Miner Res， 1998， 13(11):16911699.