作者：赵文海 韩树海 马琳娜 韩春平 周培清 胡龙虎
【摘要】 目的探讨急性白血病(AL)患者骨髓血单个核细胞表面上皮型钙黏蛋白(E-cad)的表达及其在中枢神经系统白血病(CNSL)的发生、发展、浸润、复发、预后和疗效判定中的临床意义。方法应用流式细胞术(FACS)检测骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达。结果AL组骨髓血单个核细胞(BM-MNC)表面E-cad的表达(%)显著低于对照组(P<0.01)，非CNSL组又显著高于CNSL组(P<0.01);AL组治疗后显著高于治疗前(P<0.01);非高白细胞血症组显著高于高白细胞血症组(P<0.01)。结论AL患者骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达与CNSL发生密切相关，E-cad表达的动态变化是反映AL患者病情及治疗效果的重要指标，可作为AL髓外浸润尤其是CNSL的诊断、鉴别诊断、用药监督和筛选、判定复发、疗效和预后的监测指标之一。
【关键词】 急性白血病;上皮型钙黏蛋白;高白细胞血症;中枢神经系统白血病;流式细胞术
大多数学者认为上皮型钙黏蛋白(E-cad)的表达下调与肿瘤的发生、发展及转移关系密切，是导致肿瘤细胞浸润、转移的重要因素〔1~4〕。E-cad被认为是一种重要的抑癌因子，但在血液肿瘤中研究甚少。本文旨在探讨E-cad在中枢系统白血病(CNSL)发生、发展、诊断、治疗、预后判定的价值和临床意义。
1材料与方法
1.1病例选择与分组实验组选择2008年3月至2009年10月在本院血液内科住院的急性白血病(AL)患者45例(男19例，女26例)，年龄5~65岁;急性髓系白血病(AML) 30例，其中M3型20例、M2型6例、M4型3例、M5型1例，急性淋巴细胞白血病(ALL)15例，其中L2型8例、L1型6例、L3型1例;伴CNSL组17例，未伴CNSL 28例;高白细胞血症组24例，非高白细胞血症组21例;治疗前30例，治疗后15例。对照组取自血液科非白血病的住院病人20例(男8例，女12例)，年龄12~55岁，其中血小板减少性紫癜8例、缺铁性贫血6例、营养不良性贫血2例、发热4例。
1.2方法
1.2.1材料分别于初诊时、用药前、用药后、部分缓解时、完全缓解时、出现CNSL临床症状时、复发后采集骨髓，EDTA抗凝备用。鼠抗人IgG2B单克隆抗体及其同型对照抗体由美国RD Systems Inc公司生产，购自北京尚柏生物制品有限公司。
1.2.2步骤取EDTA抗凝骨髓血3～5 ml，加入等量Ficoll分离液，离心，分离出单个核细胞，计算出原始、幼稚细胞百分率均大于70%。以PBS 调整细胞浓度为4×106/ml，取细胞悬液25 μl(包含细胞数为1×105)分别加入PE标记的E-cad单抗10 μl及其同型对照抗体10 μl，2℃～8℃避光孵育30～45 min，PBS液洗涤2次后上流式细胞仪检测(或加入0.8～1.0 ml多聚甲醛溶液4℃保存，3～4 d内上机检测)。以FSC、SSC设门于幼稚细胞群，每例检测104个细胞，分析细胞表面的MFI，计算E-cad的检测值。
1.3统计学处理采用SPSS14.0统计软件进行分析，两组样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本均数两两比较采用单向方差分析，满足方差齐性要求时应用最小显著差值法。
2结果
2.1AL组与对照组E-cad表达比较AL组骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达显著低于对照组〔(33.405±14.559)% vs (14.558±13.717)%，P<0.01〕。
2.2CNSL组、非CNSL组与对照组E-cad表达比较CNSL组骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达显著低于非CNSL组和对照组〔(6.589±8.959)%、(19.396±13.958)% vs(33.405±14.559)%，P<0.01〕;进一步两两比较， CNSL组、非CNSL组、对照组之间差异显著(均P<0.01)。
2.3AL组治疗前、治疗后与对照组E-cad表达比较AL组治疗前骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达显著低于治疗后组和对照组〔(4.631±4.481)%、(30.600±8.565)% vs(33.405±14.559)%，P<0.01〕;进一步两两比较，骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达治疗前低于治疗后，治疗后低于对照组(P<0.01)。
2.4高白细胞血症组、非高白细胞血症组与对照组E-cad表达比较高白细胞血症组骨髓血单个核细胞表面E-cad的表达明显低于非高白细胞血症组(P<0.01)，高白细胞血症组和非高白细胞血症组骨髓单个核细胞表面E-cad的表达低于对照组〔(4.693±6.640)%、(25.338±11.092)% vs(33.405±14.559)%，均P<0.01〕。
3讨论
E-cad基因的缺失可导致造血细胞与基质细胞或造血细胞与细胞外基质间黏附的破坏，影响细胞间的相互作用、造血细胞间的分化〔5〕、发育、成熟及释放入血机制，使得白血病患者不成熟细胞释放入血，表明其黏附机制遭到破坏，造血微环境发生改变。Acs等〔6〕研究显示红白血病患者均无E-cad的表达，而健康自愿者的红系造血祖细胞E-cad的表达却强阳性，这说明E-cad在从原始红细胞发育成为成熟红细胞的过程中和红白血病发生、发展、浸润过程中扮演了重要角色。Paul等〔7〕应用巢式PCR检测了白血病患者和白血病细胞株E-cad5′CPG岛甲基化状况，结果发现白血病细胞株(KG1A，U937，HL-60，A301)100%发生了甲基化，AML 53%、 ALL 32%发生甲基化。证明E-cad甲基化在白血病中可能常见，E-cad的下调可能参与了白血病的发生和发展过程。Chim等〔8〕研究提示E-cad基因下调是通过甲基化来实现的，P15甲基化的结果可用于白血病的预后判定。Corn等〔9，10〕应用RT-PCR方法也证明了白血病细胞株E-cad 100%发生甲基化，从而得出了相同的结论。由此证明了E-cad 5′CPG岛甲基化是E-cad表达减少的重要原因，而E-cad的表达下调是导致AL发生和发展的重要分子病理学机制之一，说明E-cad可以抑制白血病细胞的生长、浸润和转移，是一种新型的抑癌因子，与本文的检测结果一致。
目前，对于AL患者骨髓血中单个核细胞表面E-cad表达的下调与CNSL及高白细胞血症发生关系的研究尚未见报道。E-cad蛋白表达下调导致白血病细胞之间、细胞与基质之间黏附能力降低，从而使白血病细胞获得了从骨髓中迁移出去的动力，白血病细胞释放到外周血中，进一步发生发展，导致高白细胞血症的发生和白血病细胞的髓外浸润，导致CNSL发生。本研究表明，E-cad蛋白表达下调可能是导致高白细胞血症发生的重要分子病理学机制之一。高白细胞血症可使血液淤滞且白血病细胞具有浸润性，可浸润人体主要脏器，是导致颅内出血和死亡的高危因素〔11〕。CNSL的发生也是导致AL患者预后不良和早期复发、死亡的重要原因之一。BM-MNC表面E-cad的表达与血液中sE-cad的表达是密切相关的，二者呈反比。进一步说明由于BM-MNC表面E-cad的脱落、进入血循环后即降解为sE-cad而使细胞间黏附机制的破坏导致CNSL的发生，二者都可能作为CNSL诊断、判断预后的关键指标。本实验初步揭示了E-cad作为一种重要黏附分子和新型的抑癌因子与高白细胞血症及CNSL的发生、发展关系密切，骨髓血中单个核细胞表面E-cad的表达能否作为CNSL早期诊断、鉴别 诊断、判断浸润、转移、复发、预后和疗效观察、临床用药的筛选指标尚需更多的病例和临床观察。能否找到一种有效药物使E-cad脱甲基化使E-cad的上调，防止白血病细胞的进一步浸润、转移，从而改善白血病的预后，有待于进一步的研究和探讨。
参考文献
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