作者：赵红强 王前 安泽武 郑兴学 王鹏 陈治 齐洪峰 梁冲强 赵冠
【摘要】 目的探讨CK19 mRNA在大肠癌患者外周血的表达及临床意义。方法应用巢式RT-PCR技术检测20例健康人、20例大肠腺瘤疾病患者和90例大肠癌患者外周血CK19 mRNA的表达。结果健康人中CK19 mRNA不表达，大肠良性腺瘤疾病患者外周血中CK19 mRNA有1例表达，表达率为5%，大肠癌患者外周血中CK19 mRNA有53例，表达率为58.9%，CK19 mRNA表达率与肿瘤分期，瘤细胞的分化程度，肿瘤转移有显著相关性(均P<0.05)。结论CK19 mRNA作为检测大肠癌患者外周血微转移的分子标记物具有良好的敏感度和特异性同时CK19 mRNA可作为判断大肠癌患者的预后的指标。
【关键词】 大肠癌;外周血;CK19;巢式RT-PCR
细胞角蛋白(CK)来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白，广泛表达于上皮组织细胞中，而在间叶组织中缺乏表达〔1〕。CK19是CK家族的重要成员之一，起源于上皮组织的大肠癌保留着某些上皮组织特异性标记物的表达，而间叶组织中一般无上皮组织标记物表达〔2〕。本研究采用巢式RT-PCR技术检测CK19 mRNA在大肠癌患者外周血中的表达与Dukes分期、肿瘤细胞分化程度、血管生成、微转移和复发之间的关系。
1材料与方法
1.1研究对象随机选择2006年4月至2007年2月在我院普外科住院治疗的大肠癌患者90例，入选条件：①术前无放、化疗;②术后病理证实为管状腺癌或乳头状腺癌。健康志愿者20例，大肠良性腺瘤患者20例。
1.2临床资料90例大肠癌患者，年龄在35～65岁，中位年龄53岁，手术分期Dukes分期标准，其中A期19例，B期20例，C期40例，D期11例，管状腺癌50例，乳头状腺癌40例，按分化程度分为高分化13例，中分化57例，低分化20例。
1.3引物设计参照GenBank，利用Primer Premier 5.0引物设计软件进行引物设序列见表1，由北京赛百盛公司合成。
1.4标本收集及总RNA提取抽取约4 ml新鲜血弃去前2 ml以防抽血过程中上皮细胞污染，留取2 ml于EDTA抗凝管中，红细胞裂解液裂解红细胞，分离有核细胞，采用Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA。样本中加入1 ml Trizol试剂反复吹打使细胞裂解，加入200 μl三氯甲烷剧烈震荡，冰上静置2~5 min，120 000 r/min离心15 min，小心抽取上清放EP管中，加入等体积的预冷异丙醇与-20℃静置20 min，120 000 r/min离心10 min，可见管底有白色沉淀即是RNA，弃去上清加入无核酸酶75%乙醇洗涤RNA沉淀，充分晾干加入DEPC水溶解RNA，所得的RNA溶液用RNase-free DNaseI(Fermentas公司)处理以去除可能存在的DNA基因组污染，-80℃冰箱保存。表13种目的基因的引物序列及产物大小
1.5cDNA合成及巢式RT-PCR扩增使用cDNA合成试剂盒(Fermentas公司)根据所测RNA浓度加入2 μg RNA总反应体系为20 μl，按照说明完成cDNA第一链，巢式RT-PCR扩增条件，第1轮：94℃ 1 min，65。C50 s，72℃ 2 min，72℃ 40 s循环5次;94℃ 50 s，67℃ 50 s，72℃ 2 min，72℃ 40 s，循环25次;72℃终延伸10 min。第2轮：94℃50 s，72℃ 2 min，循环30次;72℃延伸10 min。所用反应体系为25 μl，使用2×TaqPCRMasterMix(天根公司)PCR反应体系：cDNA 2.5 μl，Primer(10μmol/L)1，2各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，DEPC水8 μl。
1.6灵敏度测试使用大肠癌细胞株A544，由中南大学湘雅医学院提供，所测灵敏度可达106。
1.7统计学方法使用SPSS 11.5统计软件进行χ2检验。
2结果
2.1总RNA鉴定实验中抽取RNA，OD260/280值在1.78~1.99之间，于1%琼脂糖凝胶中电 泳分析EB染色，凝胶成像系统中成像可见28 S，18 S条带清晰可见，见图1。
2.2巢式RT-PCR检测结果见图2。图1部分总RNA标本的琼脂糖凝胶电泳图2部分患者外周血CK19巢式RT-PCR的检测
2.3健康人、大肠良性腺瘤患者和大肠癌患者外周血中CK19 mRNA的表达情况20例健康人外周血中无CK19 mRNA表达，20例大肠良性腺瘤患者外周血中1例CK19 mRNA表达，表达率为5%，90例大肠癌患者外周血中53例CK19 mRNA表达，表达率为58.9%。大肠癌患者外周血中CK19 mRNA表达率明显高于健康人和大肠良性腺瘤患者(χ2=9.432，P<0.05) 。
2.4CK19 mRNA表达与大肠癌预后相关因素分析90例大肠癌患者中，(A+B)期的CK19 mRNA表达率为31.6%。(C+D)期为78.9%。(C+D)期患者外周血CK19 mRNA表达率明显高于(A+B)期患者(χ2=9.022，P<0.05)。高、中分化组的CK19 mRNA表达率为51.4%，低分化组为85%，低分化组的CK19 mRNA表达率明显高于高、中分化组(χ2=8.232，P<0.05)。40例患者同时获得肿瘤原发灶和转移病灶标本，原发病灶的患者外周血CK19 mRNA表达率为42%，转移灶患者外周血CK19mRNA表达率为80%。转移灶患者外周血CK19 mRNA表达率明显高于原发病灶患者。管状腺癌患者外周血的CK19 mRNA表达率为58%，乳头状腺癌为60%，无显著性差异(χ2=3.495，P>0.05)。
3讨论
CK19在肿瘤的发生和转移中发挥重要作用，将CK19作为肿瘤筛选的一种肿瘤特异性标记物基本已经基本确立〔3〕，其与肿瘤临床参数的研究已经成为热点。Saintigny等〔4〕以CK19、CK7及MUC-1 mRNA为指标用实时定量RT-PCR侦测大肠癌患者外周血认为CK19 mRNA在病患组有较高的表达，在健康志愿者外周血中低表达，并认为CK19 mRNA与大肠癌的发生有关。本研究表明，大肠癌患者外周血的阳性率要比健康志愿者和大肠良性腺瘤患者明显高。本研究还发现，CK19 mRNA C～D期大肠癌患者外周血中的阳性率显高于A～B期大肠癌患者，其以亦发现CK19mRNA在低分化大肠癌患者外周血中的阳性率明显高于高和中分化大肠癌患者。理论上起源于上皮组织的大肠癌保留着某些上皮组织特异性标记物的表达，而间叶组织中一般无上皮组织标记物表达〔2〕。如果在大肠癌外周血中检测到上皮组织特异性标记物，即可诊断为转移。早在1997年，Oossterkamp等〔5〕证明有不同数量的CK19 mRNA及蛋白被检测出，但是在非上皮来源的肿瘤细胞中的量比上皮来源的肿瘤中量要低得多。本研究发现，CK19 mRNA在伴有转移灶的大肠癌患者外周血中的阳性率明显高于只有原发灶的大肠癌患者。但CK19 mRNA在大肠癌患者病理类型之间的差异不具有统计学意义。综上所述，在大肠癌患者外周血中，CK19mRNA表达上调，CK19mRNA与大肠癌的生长和转移过程发挥着重要作用，CK19mRNA的表达与大肠癌的恶性程度和分期有关，可能作为判断大肠癌预后的指标。
参考文献
1Kruger W，Zander AR.MUC1 expression in hemopoietic tissues〔J〕. Hematotheer Stem Cell Res，2000;9(4):409-10.
2Iwao K，Watanabe T，Fujiwara Y，et al.Isolation of a novel human lung-specific gene LUNX，a potential molecular marker for detection of micrometastasis in colon cancer〔J〕.Int J Cancer，2001;91(4):433-7.
3Pelkey TJ，Frison HF，Bruns DE.Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumor〔J〕.Clin Chem，1996;2(9):1369-81.
4Saintigny P，Coulon S，Kambouchner M，et al.Real-time RT-PCR detection of CK19，CK7 and MUC-1 mRNA for diagnosis of lymph node micrometastases in colon carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2005;115(6):777-82.
5Oosterkamp HM，Scheiner L，Stefanova MC，et al.Comparison of MUC-1 expression in epithelial and non-epithelial cancer cell lines and demonstration of a new short variant form(MUC-1/Z)〔J〕.Int J Cancer，1997;72(1):87-94.