作者：杜月光 万海同 李芳芳
【摘要】 目的探讨人重组骨形成蛋白-7(rhBMP-7)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)基因表达及细胞外基质(ECM)成分Ⅳ型胶原(ColⅣ)和纤维黏连蛋白(FN)分泌的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为四组：正常对照组(DMEM培养基含1 000 mg/L葡萄糖)、高糖组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡 萄糖)、rhBMP-7低剂量组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡萄糖+50 nmol/L rhBMP-7)、rhBMP -7高剂量组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡萄糖+100 nmol/L rhBMP-7)。RT-PCR技术检测TGF-β1和CTGF基因表达水平，ELISA技术检测上清液中TGFβ1、ColⅣ、FN含量。结果高糖组系膜细胞TGF-β1和CTGF mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.01)，TGF-β1、ColⅣ和FN分泌增多，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较，rhBMP-7不同剂量(50、100 ng/ml)TGF-β1和CTGF mRNA表达明显降低，培养上清中TGF-β1、ColⅣ及FN分泌量亦明显减少，且差异显著(P<0.05)。结论RhBMP-7通过抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF基因表达和ECM的分泌可能起到抗纤维化作用。
【关键词】 rhBMP-7;转化生长因子-β1;结缔组织生长因子;细胞外基质
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of rhBMP-7 on the expression oftransforming growth factor-β1 (TGF-β1)， connective tissue growth factor(CTGF) and the extracellular matrix type Ⅳ collagen (Col Ⅳ) and fibronectin (FN) induced by high glucose in rat glomerular mesangial cell.MethodsRat glomerularmesangial cells were cultured in vitro.The cells were pided into 4 groups: control (DMEM containing 1 000 mg/L glucose)， high glucose (DMEM containing 4 500mg/L glucose)， rhBMP-7 low (DMEM containing both 4 500 mg/L glucose and 50 ng/mlrhBMP-7) and high (DMEM containing both 4 500 mg/L glucose and 100 ng/ml rhBMP-7).TGF-β1 and CTGF mRNA expression were measured by semi-quantitative RT-PCR.Synthesis of TGF-β1， Col Ⅳ and FN in cultured mesangial cells were determined by ELISA.ResultsHigh glucose stimulated the upregulation of TGF-β1 and CTGFmRNA and synthesis of TGF-β1， FN and Col Ⅳ， compared with control group (P<0.05).RhBMP-7 significantly inhibited high glucose mediated upregulation of TGF-β1， CTGF mRNA expression and synthesis of TGF-β1， FN and ColⅣ， comparedwith high glucose group (P<0.05).ConclusionsRhBMP-7 plays arteriosclerosis role viainhibiting TGF-β1 and CTGF mRNA expression induced by high glucose in rat glomerular mesangial cell， subsequently inhibiting the deposition of FN and Col Ⅳ.
【Key words】RhBMP-7; Transforming growth factor-β1; Connective tissue growth factor; Extracellular matrix
研究发现，骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对维持肾脏的生理功能至关重要，其表达的降低与糖尿病肾病(DN)、阻塞性肾病等多种急慢性肾脏疾病的发生发展有关，外源性BMP-7治疗却有减轻肾脏损伤，具有抗纤维化作用〔1〕。目前，BMP-7作为纤维化的负性调节因子，可影响肾小管上皮细胞TGF-β1/Smads传导途径以及与TGF-β1的互逆作用，对肾纤维化起到预防及逆转作用，从而避免慢性肾衰竭发生〔2〕。目前尚未见BMP-7对高糖诱导的系膜细胞作用影响的报道。本实验研究人类重组BMP-7(rhBMP-7)对高糖诱导的肾系膜细胞纤维化因子表达及其细胞外基质(ECM)成分分泌的影响，为其作为DN防治的靶点提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验对象大鼠肾小球系膜细胞，由杭州市中医院肾病中心王永军教授惠赠。
1.2主要试剂及仪器rhBMP-7购自R&D Systems公司;纤维黏连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)及TGF-β1试剂盒(ELISA法)购自上海森雄科技有限公司;RNA抽提试剂盒和RT-PCR试剂盒购自Promega公司;PCR所用引物由上海生工公司合成。超净工作台购自苏州净化设备公司;CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司;凝胶成像系统(型号为Tanon Gis-2009)购自上海天能科 技有限公司。
1.3肾小球系膜细胞培养将系膜细胞在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素及HEPES的低糖DMEM培养基，37℃和5% CO2常规培养，待细胞生长铺满培养瓶的70%~80%进行传代，一般2～3 d传代1次。
1.4给药分组取对数生长期细胞接种于24孔板，常规培养24 h后，用0.5%的血清培养基孵育24 h，然后使细胞周期同步化后，根据以下分组给药：①正常对照组(含1 000 mg/L 葡萄糖的DMEM 培养液);②高糖组(含4 500 mg/L 葡萄糖的DMEM 培养液);③rhBMP-7低剂量组(含 50 ng/ml rhBMP-7和4 500 mg/L 葡萄糖的DMEM 培养液);④rhBMP-7高剂量组(含100 ng/ml rhBMP-7和4 500 mg/L 葡萄糖的DMEM 培养液)，每组同时设3个复孔。分别刺激24 h后终止培养，收集细胞上清液和细胞用于指标检测。
1.5RT-PCR法检测肾小球系膜细胞TGF-β1和结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达用Trizol试剂破碎细胞，抽提细胞的总RNA，使用逆转录试剂，以oligo dT为引物，取总RNA 2μg进行逆转录反应。之后以50 μl反应体系进行体外PCR扩增，以β-actin作为内参。TGF-β1引物序列为：上游5′-CACCATCCATGACATGAACC-3′;下游5′-TCATGTTGGACAACTGCTCC-3′，扩增产物大小为385 bp。CTGF引物序列为：上游5′-CTAAGACCTGTGGGATGGGC-3′;下游5′-CTCAAAGATGTCATTGTCCCC-3′。扩增产物大小为383 pb。β-actin引物序列为：上游5′-ATGCCATCCTGCGTCTG-3′;下游5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，扩增产物大小为598 bp。反应条件为94℃预变性30 s，进入94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，CTGF、TGF-β1和β-actin均为30个循环;反应结束前72℃10 min以充分延伸。最后将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳(80 V，60 min)，应用凝胶图像处理系统分析图像并计算各条带平均吸光度，以β-actin作为内参照对PCR目的基因产物进行半定量分析。
1.6ELISA法检测细胞培养上清液TGF-β1、ColⅣ、FN含量收集细胞培养上清液，严格按照试剂盒说明书操作，按标准曲线计算出待测样品中TGF-β1、ColⅣ、FN含量。
1.7统计学处理用SPSS13.0统计软件，数据以x±s表示，采用单因素方差分析比较各组间差异。
2结果
2.1rhBMP-7对高糖诱导肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF mRNA表达的影响高糖刺激肾小球膜细胞24 h上调TGF-β1、CTGF mRNA表达;rhBMP7不同剂量干预后，明显抑制了高糖诱导肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF mRNA表达上调，与高糖组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1，表1。
2.2rhBMP-7对高糖诱导肾小球系膜细胞分泌TGF-β1蛋白的影响从ELISA结果可以看出，高糖刺激肾小球系膜细胞24 h，上清液中TGF-β1含量增加;rhBMP-7干预，使高糖诱导肾小球系膜细胞分泌TGF-β1含量下降，无论是高剂量还是低剂量，与高糖组相比，差异显著(P<0.01)，见表2。
2.3rhBMP-7对高糖诱导的肾小球系膜细胞分泌ColⅣ、FN表1rhBMP-7对高糖诱导的RMC TGF-β1、CTGF mRNA 表达的影响图1rhBMP-7对高糖诱导肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF mRNA表达的影响表2rhBMP-7 对高糖诱导的肾小球系膜细胞分泌TGF-β1、ColⅣ、FN的影响
3讨论
研究发现，TGF-β1是致肾纤维化的核心因子，参与肾小球硬化的各个环节〔3〕，活化的TGF-β1可使基质合成增多、基质降解抑制、促进ECM的合成、诱导细胞生长停顿和凋亡，且对单核细胞进行趋化。CTGF具有促进成纤维细胞活化和ECM产生、积聚等功能，被认为是介导TGF-β1促纤维化活性的下游效应因子。在刺激细胞增生和ECM合成，促进组织器官纤维化方面起重要作用。研究表明，在DN患者或实验性大鼠，肾组织中CTGF表达明显增高，并与其肾功能的损伤密切相关〔4〕，相反针对CTGF的治疗可以改善肾功能，ECM积聚减少〔5〕。在糖尿病状态下，高血糖是产生一系列代谢紊乱的根源，是导致肾脏病变进展的中心环节，导致肾小球系膜细胞ColⅣ、FN等细胞外基质水平升高。本研究结果显示在高糖环境下，肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF基因表达升高，ColⅣ、FN分泌增多，进一步证实了高糖在DN发生发展中的作用。
BMP-7是骨形态蛋白家族的成员，具有广泛的生理功能，尤其在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用。BMP-7的受体有Ⅰ型与Ⅱ型两种，两者均是丝氨酸/苏氨酸跨膜蛋白激酶受体，与BMP7结合后，传递信号，产生靶效应〔1〕。近年发现DN的发生发展与BMP-7减少有关，而BMP-7治疗则可减轻肾脏损害，具有抗纤维化的作用〔6〕。BMP-7作为纤维化的负性调节因子，通过维持上皮细胞表型、抑制肾脏上皮细胞的凋亡;促进ECM的降解、减少多种促炎症因子表达〔7，8〕;影响TGF-β1/Smads传导途径以及与TGF-β1的互逆作用，对肾纤维化起到预防及逆转作用，从而避免慢性肾衰发生〔2〕。但是BMP-7是否可抑制高糖诱导的系膜细胞CTGF及TGF-β1的表达及其ECM的合成还没有相关报道，为此，本实验研究观察人类重组BMP-7干预对高糖诱导的系膜细胞TGF-β1、CTGF基因表达及ECM分泌的影响，结果显示rhBMP-7在体外可抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF的基因表达及ECM分泌，提示BMP-7可能通过抑制TGF-β1、CTGF的基因表达进而使ECM的分泌减少，从而起到抗纤维化作用。
参考文献
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