作者：刘桂林1 张继东 窦迎春2 王博 任敏 乔云
【摘要】 目的观察益肾活血提取液对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CD40、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响。方法原代培养HUVECs，取3~5代细胞用于试验，提取细胞RNA及蛋白。采用实时定量RT-PCR检测HUVECs VCAM-1 mRNA表达，采用Western印迹法观察HUVECs CD40及MMP-9的蛋白表达变化。结果刺激组CD40、MMP-9及VCAM-1的表达较空白组明显升高(1.48±0.34 vs 0.45±0.16;1.54±0.16 vs 0.62±0.12， 12.82±0.16 vs 1.00±0.01，P均<0.001 )，大、中、小剂量的益肾活血提取液可以不同程度地抑制oxLDL诱导的HUVECs、CD40、MMP-9及VCAM-1的高表达。结论益肾活血提取液具有改善内皮细胞功能的作用，其机制与抑制oxLDL诱导的HUVECs CD40、MMP-9及VCAM-1的高表达有关。
【关键词】 益肾活血提取液;氧化型低密度脂蛋白;白细胞分化抗原;基质金属蛋白酶-9;血管细胞黏附分子-1
目前认为动脉粥样硬化(AS)是一多因素、多基因引起的复杂的慢性炎症性疾病。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的内皮损伤与激活参与了AS的形成。白细胞分化抗原40(CD40)与CD40配体的相互作用参与了AS斑块的形成与破裂，在斑块内炎症反应过程中起重要作用〔1~3〕。血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)通过与配体相互作用参与 T细胞-T细胞、T细胞-基质杀伤细胞-靶细胞之间的相互作用，与AS过程中炎症免疫反应密切相关〔4〕。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)可降解血管壁的胶原纤维，弹力蛋白，玻璃体结合蛋白等，促进斑块的形成、不稳定与破裂。益肾活血提取液以益肾活血为组方原则，佐以化痰祛瘀，临床研究证实其有降低冠心病患者血清内皮素、肿瘤坏死因子α水平，升高一氧化氮水平的作用〔5〕，为进一步阐 明其抗AS作用的机制，本研究观察了益肾活血提取液对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) CD40， MMP-9及VCAM-1表达的影响。
1材料与方法
1.1主要试剂M199干粉培养基，美国Gibco公司生产。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。胰蛋白酶，美国Sigma公司生产。重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(贝复济)，珠海亿胜生物制药有限公司。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技术有限公司。oxLDL，广州中山大学提供。兔抗小鼠/人 CD40多克隆抗体，兔抗小鼠/人MMP-9多克隆抗体，兔抗人/小鼠CD31单克隆抗体，均为英国Abcam公司产品。兔抗人/小鼠/大鼠β-actin多克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品。山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Trizol，美国Invitrogen公司生产。RNA反转录试剂盒和SYBRPremix Ex TaqTMDRR041S试剂盒，TaKaRa大连宝生物工程有限公司。DNA Marker，北京天根生化公司产品。蛋白裂解液(RIPA)和二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。脱脂奶粉，黑龙江省完达山乳业股份有限公司。硝酸纤维素膜，0.2 μm孔径，美国Invitrogen公司产品。预染蛋白质 Marker，北京天根生化公司产品。放射自显影胶片，美国Amersham hamacia Biotech公司产品。其余试剂为国产或进口分析纯。
1.2方法
1.2.1益肾活血提取液制备药物组成：枸杞、丹参、生黄芪、黄精、川芎、水蛭、瓜蒌皮、大黄、黄连。以上生药材由 济南建联药材公司提供。生药材经过二次干燥之后，按处方比例混匀，室温下加入蒸馏水浸渍1 h;煎煮两次，每次煎煮1 h;将过滤后的滤出液混合，之后两次醇沉，再行水提，浓缩成含生药1 g/ml的药液，-20℃保存，稀释使用。
1.2.2HUVECs原代培养无菌获取健康剖宫产妇新生儿脐带15~20 cm，剪去钳痕，以PBS冲洗脐静脉管腔。将脐带的一端用止血钳夹闭，注入0.125%胰蛋白酶消化液于超净台上室温消化10~13min。用无菌空针将消化液抽出，置于离心管内，再以PBS冲洗管腔，洗出液置于离心管内，加入2 ml胎牛血清终止消化。1 000 r/min，离心8~10 min。于超净台内将离心管内的上清液倒掉，以全培养基(M199+20%胎牛血清+3%重组牛碱性成纤维细胞生长因子+1% HEPES)将细胞悬浮，转移至25 cm2的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵箱中培养，12~24 h后换液，清除未贴壁细胞，以后每3~4 d换液一次。见图1。
1.2.3细胞传代待原代细胞融合成单层后，用PBS将细胞洗两遍，然后加入0.125%胰酶2 ml，消化3~5 min，在倒置相差显微镜下观察见细胞变成圆形，吸出胰酶，加入培养基(M199+10%胎牛血清+3%重组牛碱性成纤维细胞生长因子+1% HEPES)，轻轻吹打，待细胞全部悬浮，按105个/ml分装，放回37℃孵箱中继续培养。
1.2.4内皮细胞鉴定免疫荧光法检测CD31。HUVECs接种于预先置于细胞培养板内的盖玻片上至细胞长成单层，弃培养液，PBS洗3次，加入95%乙醇固定30 min， PBS冲洗，采用免疫荧光染色:滴加1∶10兔抗人CD31抗体血清，再滴加1∶40荧光素标记的羊抗兔免疫荧光抗体，设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。见图1。
1.2.5实验分组取处于对数生长期的3～5代HUVECs进行消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml接种于6孔培养板，每孔分别2 ml，置于CO2培养箱静置培养24 h。然后更换乏血清培养基(M199+2%胎牛血清+1% HEPES)继续培养6 h，使细胞同步化于G0/G1期，随机分为5组：①空白组：不加任何药物;②刺激组：终浓度50 μg/ml oxLDL;③益肾活血提取液大剂量组(大剂量组)：50 μg/ml oxLDL+1 mg/ml益肾活血提取液;④益肾活血提取液中剂量组(中剂量组)：50 μg/ml oxLDL+500 μg/ml的益肾活血提取液;⑤益肾活轿提取液小剂量组(小剂量组)：50 μg/ml oxLDL+100 μg/ml的益肾活血提取液。每组设3个复孔，其中各药物处理组先用上述药物预处理细胞24 h后，再给予oxLDL刺激24 h;刺激组给予终浓度50 μg/ml oxLDL刺激24 h。然后用0.125%胰蛋白酶进行消化，制备细胞悬液用于实验。实验重复3次。
1.2.6VCAM-1 mRNA检测细胞培养结束后吸出培养液，按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。用Oligo dT、dNTP和莫 洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA。人VCAM-1基因与内参基因β-actin引物由上海博亚公司(BioAsia)合成，引物序列为：VCAM-1上游5′- CGAAAG GCC CAG TTG AAG GA-3′;下游5′- GAG CAC GAG AAG CTC AGG AGA AA-3′。β-actin上游5′- TGG ACA TCC GCA AAG AC-3′;下游5′- GAA AGG GTG TAA CGC AACTA-3′。反应条件：95℃预变性10 s，58℃ (VCAM-1)、52℃(β-actin)退火5 s，72℃延伸10 s，共50个循环，最后40℃ 30 s结束反应。采用2-ΔΔCT方法对VCAM-1的mRNA表达进行相对定量分析，VCAM-1扩增倍数用比正常对照组基因扩增的增高倍数表示。
1.2.7CD40、MMP-9蛋白检测提取蛋白并定量，经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，封闭，加一抗(一抗浓度：CD40为1∶100， MMP-9为1∶800);4℃过夜，洗膜3次，每次10 min;加辣根过氧化物酶标记的二抗(二抗浓度1∶10 000)，37℃ 1 h;洗膜3次，每次20 min;化学发光试剂增强反应，X线片压片曝光。经光密度仪扫描分 析，计算CD40， MMP-9的蛋白表达量。
1.3统计学处理使用SPSS11.5统计软件，数据以x±s表示，组间差异采用独立样本t检验。
2结果
2.1益肾活血提取液对oxLDL诱导的HUVECs VCAM-1 mRNA 表达的影响刺激组VCAM-1 mRNA 的表达明显高于空白组(12.82±0.16 vs 1.00±0.01，P<0.001)。 给予大、中、小剂量益肾活血提取液预处理后，VCAM-1 mRNA 的表达均较刺激组明显降低(1.99±0.28，3.6±1.46，8.90±2.50，P<0.05)， 其中大剂量组与小剂量组显著差异(P<0.05)。图1HUVECs及鉴定(×200)
2.2益肾活血提取液对oxLDL 诱导的HUVECs CD40 蛋白表达的影响空白组有少量的CD40表达，刺激组CD40表达明显高于空白组(1.48±0.34 vs 0.45±0.16，P<0.001)。大、中剂量益肾活血提取液可以抑制oxLDL诱导的CD40蛋白表达(0.75±0.09，0.94±0.17，P<0.05)，小剂量组(1.18±0.14)与刺激组相比无显著差异(P<0.05)，见图2。
2.3益肾活血提取液对oxLDL诱导的HUVECs MMP-9蛋白表达的影响刺激组MMP-9表达明显高于空白组(1.54±0.16 vs 0.62±0.12，P<0.001)。大、中、小剂量组益肾活血提取液处理组MMP-9的表达均较刺激组显著降低(0.68±0.06， 0.84±0.08和1.09±0.09vs 1.54±0.16，P<0.001或P=0.001)，其中大、中、小剂量组相比亦有显著性差异(P<0.01)。见图2。a～e：空白组、刺激组、小、中及大剂量组图2益肾活血提取液对oxLDL 诱导的HUVECsCD40、MM-9表达的影响
3讨论
本研究结果表明，oxLDL能够诱导体外培养的HUVECs高表达CD40， MMP-9和VCAM-1。给予益肾活血提取液预处理细胞后，再给予oxLDL刺激，可以使CD40， MMP-9和VCAM-1的表达降低。以往研究表明oxLDL可诱导体外培养的内皮细胞高表达CD40和CD40L〔6〕，本研究结果与之相符。本研究结果显示，益肾活血提取液可以抑制oxLDL诱导的UVECs、CD40的高表达，并且大剂量组及中剂量组明显优于小剂量组，这可能是其抗AS的重要机制。ECs受损后除表达CD40外，还可表达VCAM-1。研究表明VCAM-1在 AS患者的脂纹期主要表达于动脉ECs表面，可促使单核细胞向ECS黏附，加剧血管内皮的损伤;在纤维斑块期，VCAM-1在斑块内的表达增强，其作用主要是促进单核细胞迁移及向MΦ转化，触发局部免疫反应〔7〕。用基因敲除或抗体阻断VCAM-1的表达可降低单核细胞向ECs的黏附，延缓AS进程〔8〕。研究表明oxLDL可以诱导HUVECs高表达VCAM-1，这与以往的研究相符〔9〕。给予不同浓度的益肾活血提取液预处理细胞后，VCAM-1的m RNA表达呈现不同程度的降低，提示益肾活血提取液可通过降低oxLDL诱导的VCAM-1在ECs中的表达减轻炎症，改善血管内皮功能。
本研究首次发现oxLDL可以诱导HUVECs高表达MMP-9。MMP-9的活性增高与不稳定性心绞痛，冠状动脉及颈动脉的斑块破裂及腹主动脉瘤的形成有密切关系〔10〕。而不同浓度的益肾活血提取液对MMP-9的增高均有显著抑制作用。综上所述，oxLDL能够诱导体外培养的HUVECs高表达CD40， MMP-9和VCAM-1。益肾活血提取液可以抑制oxLDL诱导的HUVECs CD40， MMP-9和VCAM-1的高表达;且随着益肾活血提取液浓度的增加，CD40、 MMP-9和VCAM-1的表达逐渐降低，提示在一定浓度范围内，益肾活血提取液对oxLDL诱导的HUVECs CD40、 MMP-9和VCAM-1的表达具有剂量依赖性。益肾活血提取液对oxLDL引起的内皮细胞功能障碍具有一定程度改善作用，从而揭示了其抗AS的部分机制。
参考文献
1Garlichs CD， Eskafi S， Raaz D，et al.Patients with acute coronary syndromes express enhanced CD40 ligand /CD154 on platelets〔J〕.Heart， 2001;86(6)：649-55.
2Mach F， Schnbeck U，Fabunmi RP，et al.T lymphocytes induce endothelial cellmatrix metalloproteinase expression by a CD40L-dependent mechanism：implications for tubule formation〔J〕.Am J Pathol， 1999;154(1)：229-38.
3Viallard JF， Solanilla A， Gauthier B，et al.Increased soluble and platelet-associated CD40 ligand in essential thrombocythemia and reactive thrombocytosis〔J〕.Blood， 2002;99(7):2612-4.
4Singh RJ， Mason JC， Lidington EA，et al.Cytokine stimulated vascular celladhesion molecule-1 (VCAM-1) ectodomain release is regulated by TMP-3〔J〕.Cardiovasc Res， 2005;67(1)：39-49.
5杨瑞雪， 张继东， 罗玮敏， 等.益肾活血胶囊对不稳定型心绞痛患者 Hcy及ET、TNF-α、NO的影响〔J〕.上海中医药杂志，2006;40(1):22-4.
6Li D， Liu L， Chen H，et al.LOX-1， an oxidized LDL endothelial receptor，induces CD40/CD40L signaling in human coronary artery endothelial cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003;23(5):816-21.
7Davies MJ， Gordon JL， Gearing AJ，et al.The expression of the adhesion molecules ICAM-1， VCAM-1， PECAM， and E-selectin in human atherosclerosis〔J〕.J Pathol， 1993;171(3)：223-9.
8Barringhaus KG， Phillips JW， Thatte JS，et al.Alpha4beta1 integrin (VLA-4)blockade attenuates both early and late leukocyte recruitment and neointimal growth following carotid injury in apolipoprotein E-/- mice〔J〕.J Vasc Res， 2004;41(3):252-60.
9Takei A，Huang Y，Lopes-Virella MF.Expression of adhesion molecules by human endothelial cells exposed to oxidized low density lipoprotein.Influences of degreeof oxidation and location of oxidized LDL〔J〕. Atherosclerosis， 2001;154(1)：79-86.
10Alvarez B， Ruiz C， Chacón P，et al.Serum values of metalloproteinase-2 and metalloproteinase-9 as related to unstable plaque and inflammatory cells in p atients with greater than 70% carotid artery stenosis〔J〕.J Vasc Surg， 2004;40(3):469-75.