作者：王瑞英 常湛 李娟 王倩 张松筠
【摘要】 目的观察甲状腺功能减退症(甲减)大鼠肾脏损伤时足细胞损伤标志Desmin蛋白在肾组织中的表达，探讨甲减肾脏损伤的发生机制以及与甲状腺功能的关系。方法用丙基硫氧嘧啶(PTU)连续灌胃制作甲减大鼠模型。分别动态观察对照组、甲减组和干预组〔给予左甲状腺素钠(L-T4)和停止给予PTU进行干预治疗〕大鼠的肾脏病理改变及损伤情况，并同时应用免疫组化技术检测Desmin在肾组织中的表达情况。结果甲减大鼠出现肾脏损伤，并且随着病程进展逐渐加重，并与甲状腺功能密切相关。干预组肾组织损伤均较甲减组减轻。结论甲减时肾脏损伤与足细胞相关，甲状腺激素参与足细胞损伤。
【关键词】 甲状腺功能减退症;肾脏损伤;Desmin;足细胞
【Abstract】ObjectiveTo study the expression of the Desmin albumen in hypothyroidism rats， reveal the pathology of occurrence and development of the renal injury in hypothyroidism and explore the relationship in the renal injury and the thyroid function.MethodsModel of hypothyroidism rats was made by giving them propylthiouracil (PTU). The pathology condition of the control group and hypothyroidism group was examined by dynamic viewing. The immunohistochemistry was used todetermine the expression of Desmin albumen in the renal of the control， hypothyroidism and intervention groups (giving the levothyroxine sodium and stopping PTU).ResultsThe renal injury appeared in hypothyroidism rats. With the development of the disease， the renal injury was aggravated progressively， which was related with the thyroid function. The renal injury had reduced after intervention. ConclusionsThe renal injury is related with the podocytein hypothyroidism rats and thyroid hormone participates in regulating the injury of podocyte.
【Key words】Hypothyroidism; Renal injury; Desmin albumen; Levothyroxine Sodium
甲状腺功能减退症(简称甲减)时体内甲状腺激素缺乏，可从多方面造成肾脏的损害，导致了肾脏结构和功能的改变，并随着甲减程度的加重而加重，最终导致肾脏纤维化、肾衰竭〔1~3〕。足细胞损伤标志Desmin蛋白作为肌源性细胞的标志，正常情况下肾小球系膜细胞可偶见少量表达，而足细胞无明显表达。当足细胞因各种原因发生损伤时，可大量表达Desmin而发生表型转化。损伤的足细胞一方面可因为结构异常而导致肾功能改变，加重肾损害进程;另一方面其自身也可表型转化为纤维样细胞，直接或通过产生某些促细胞外基质(ECM)生成因子，促使ECM积聚，从而最终导致肾组织硬化和纤维化。本实验通过口服丙基硫氧嘧啶(PTU)制作甲减大鼠模型，通过免疫组织化学方法检测大鼠肾脏Desmin蛋白的表达，同时监测血脂、肾功能及大鼠肾组织在电镜下病理情况，进一步了解甲减性肾脏损伤的特点及产生机制;同时部分给予单纯停止PTU，部分给予停止PTU加服甲状腺激素-左甲状腺素钠(L-T4)干预治疗，探讨甲状腺功能恢复快慢及恢复程度对甲减性肾脏损伤的影响，以及对肾脏损伤恢复的影响。
1材料与方法
1.1动物分组及模型建立健康SD雄性大鼠84只，体重180~200 g，动物合格证编号是DK0503-0062，由河北医科大学动物中心提供。所有动物购回后适应性喂养1 w，无不良反应，饮食、水正常者，即纳入实验。将84只SD大鼠随机分为A、B两组，室温20～25℃，光照与黑暗每日12 h更替，普通饲料和三蒸水喂养。A组(正常对照组，30只)：给予同甲减组大鼠等剂量的三蒸水灌胃，每日1次。随机分为5组，每组6只，分别于3、6、8、10、12 w经心脏取血，宰杀，取肾脏。B组(甲减组，54只)：给予PTU连续灌胃制备甲减动物模型，将PTU溶于三蒸水中，按大鼠每天每100 g体重给予20 mg PTU，计算相应的剂量(每周称量体重1次，根据体重改变药物量)。分别于3、6、8 w各取6只经心脏取血，宰杀，取肾脏。于8 w时起将剩余36只动物随机分为 三组，B1组12只：继续给予原量PTU灌胃;B2组12只：停止给予PTU改为等量三蒸水灌胃;B3组12只：给予L-T4，将L-T4溶于三蒸水中，每只大鼠每天每100 g体重给予6μg L-T4灌胃治疗，以上三组同期分别于10、12 w取血，宰杀，取肾脏。
1.2试剂兔抗大鼠Desmin蛋白多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒，DAB显色剂及山羊血清均购于武汉博士德生物科技有限公司;血清促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)试剂盒由中国原子能研究所提供;血脂、肾功能试剂购自河北博海生物工程开发有限公司;PTU购自上海复星朝辉药厂，规格：50 mg×100片/盒;L-T4(商品名为优甲乐)，德国默克公司产品。
1.3方法
1.3.1动物标本的提取处死各组实验大鼠前一天禁食水，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经心脏取血，分别用以检测TSH、FT3、FT4、血脂、肾功能，迅速取出肾脏，滤纸吸干水分，制备病理样品。
1.3.2肾脏组织Desmin免疫组化染色按SP法免疫组化试剂盒染色步骤进行，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3.3电镜取肾脏组织切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，2.5%戊二醛固定，包埋前经0.1 mol/LPBS充分冲洗，1%四氧化锇后固定2 h，0.1 mol/L PBS充分冲洗，梯度酒精逐级脱水，中性树脂包埋，LKB682型超薄切片机切片，厚度50 nm，切片用乙酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色，日立-H7500透射电子显微镜下观察拍照。
1.3.4切片观察及结果判定
所有标本均在MoticMed 6.0数码医学图像分析系统内在放大400倍数下，Desmin结果进行半定量分析，每份标本测10个肾小球，用积分光密度(IOD)表示阳性物质的相对含量。
1.4统计学处理所有处理数据均采用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。变量之间采用直线相关分析方法。
2结果
2.1血清TSH、FT3、FT4水平与A组相比，B组大鼠从灌胃大约3 w起开始出现饮食水减少，活动减少，对外界环境刺激反应淡漠。部分甲减大鼠出现后颈部毛发脱落，稀疏。血清FT3，FT4降低及TSH升高。B2组及B3组大鼠较B1组大鼠有所增加，活动及对外界刺激均好于B1组大鼠。见表1、表2。
2.2透射电镜 A组大鼠肾小球足细胞结构完整，足突排列整齐清晰。甲减组大鼠肾小球基底膜不规则旋绕卷曲;足细胞足突局灶性融合;毛细血管内皮窗孔径增大;足细胞线粒体嵴部分或大部分融合或消失，部分膜融合、消失;粗面内质网有脱颗粒现象，并且这些病变随着甲减病情的加重而加重。B2组和B3组与B1组相比病变明显减轻。见图1。
2.3肾组织Desmin表达变化正常大鼠肾小球内偶见散在Desmin表达;而甲减大鼠肾小球内Desmin表达显著增多，随着甲减病程的进展，Desmin表达呈递增趋势，B组比同期A组相比，在3 w时表达率增加(P<0.05)，在6、8、10、12 w时表达明显增加(P<0.01)。在10和12 w时B2组和B3组染色均较B1组变浅，表明Desmin表达较B1组均显著减少(P<0.01)，但B2组和B3组同期比较只在12 w时差异有显著性(P<0.05)。见表3、图2。表1两组血清TSH、FT3、FT4水平比较表2B1、B2和B3组血清FT3、FT4及TSH比较表3免疫组化测定Desmin蛋白在肾组织中的表达表4两组间肾功能比较
2.4肾功及血脂情况B组大鼠在3 w时血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)较对照组无明显差异，在6、8、10、12 w时均较对照组显著增高(P<0.05);并且随着病程进展呈进行性增高，见表4。在10 w时，B2组大鼠BUN、Cr均较B1组减低，但无统计学意义;B3组大鼠BUN、Cr均较B1组减低(P<0.05)。12 w时，B2组大鼠BUN、Cr均较B1组减低(P<0.05);B3组大鼠BUN、Cr均较B1组减低(P<0.01)。B2组和B3组同期比较只有在12w时有显著性差异(P<0.05)，在10 w时无显著差异。见表5。B组大鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)在3、6、8、10、12 w时均较对照组显著增高(P<0.05)，高密度脂蛋白(HDL)在3 w时较对照组无明显差异，在6、8、10、12 w时较对照组显著减低(P<0.01)。TC、TG、LDL随着病程进展呈进行 性增高，HDL呈进行性减低。见表6。10 w时，B2组大鼠TC、TG、LDL均较B1组减低，HDL较B1组升高，但均无统计学意义;B3组大鼠TC、TG、LDL均较B1组减低(P<0.05)，HDL较B1组升高(P<0.05)。12 w时，B2组大鼠TC、TG均较B1组减低(P<0.05)，LDL 较B1组减低(P<0.01)，HDL较B1组升高，但无统计学意义;B3组大鼠TC、TG、LDL均较B1组显著减低(P<0.01)，HDL较B1组显著升高(P< 0.01)。B2组和B3组同期血脂比较无显著性差异。见表6，表7。表5B1、B2和B3组肾功能比较图1大鼠肾组织透射电镜结果(EMS，×20 000)图2Desmin蛋白表达变化(S-P，×400)表6A、B两组间血脂比较表7B1、B2和B3组血脂比较
2.5各指标之间的相关性B组大鼠的肾功能BUN、Cr与FT3、FT4呈负相关，与TSH呈正相关;血脂TC、TG与FT3、FT4呈负相关(均P<0.01)，LDL、HDL与FT3、FT4未呈现明显相关性;足细胞损害标志Desmin蛋白结果显示与FT3、FT4呈负相关(r=-0.948，-0.871)，与TSH呈正相关(r=0.841，均P<0.05)。见表8、9。表8B组肾功能与甲功之间相关性 表9B组血脂与甲功之间相关性
3讨论
本实验采用经灌胃给予抗甲状腺药物PTU抑制甲状腺激素合成来模仿甲减的病理生理过程，制作甲减大鼠模型。给予PTU灌胃3 w时起大鼠即开始出现饮食水减少，活动减少，体重减轻，对外界环境刺激反映淡漠。部分大鼠出现后颈部毛发脱落、稀疏。上述症状均符合甲减的临床特点。检测3 w时甲状腺功能情况显示FT3和FT4均较对照组显著减低，TSH较对照组显著增高，与范强〔3〕等所报道的甲减模型制作成功后大鼠的一般状态及甲功改变基本一致，标志着甲减模型复制成功。项莹等〔4〕通过研究发现甲减患者通过L-T4替代治疗后甲功会得到很好的恢复，本实验中发现经L-T4替代治疗4 w后甲功已基本接近正常水平，FT3和FT4比正常对照组略低但无明显差异(P>0.05)，TSH比对照组略高，相比也无统计学意义(P>0.05)，与其报道相一致。甲减时由于甲状腺激素不足可对肾脏功能以及肾脏血流动力学产生影响。初期肾血流量、肾小球滤过率下降，肾小管的重吸收及最大分泌能力改变，尿量减少，水排泄负荷延迟。长期甲减造成肾血流量，肾小球滤过率下降更为明显，除肾小管回吸收减少更严重外，还因高尿酸血症，引起间质性肾炎，间质纤维变，肾脏损害进一步加重，使BUN、Cr升高〔5，6〕。本实验中肾功能检测结果：甲减组大鼠在3 w时BUN、Cr较对照组升高，但无明显差异，6 w时较对照组增高，8、10、12 w时均较对照组显著增高，且随着病程进展呈进行性增高。Mooraki等〔7〕对4例由于甲减所致的急性肾衰患者左旋甲状腺素治疗前后的Cr和肌酐清除率(Ccr)进行测定发现，经左旋甲状腺素治疗6~12 w后，Cr有明显下降，而Ccr则有明显上升。由此可见，甲状腺激素的缺乏会严重影响到肾血流量、肾小球滤过率、Cr、BUN和Ccr。本实验结果与以上报道相符。同时甲减患者体内TC、LDL、TG及载脂蛋白(Apo)B水平都会明显增高〔7〕。高脂血症是肾损伤的危险因素之一，它不仅可刺激肾脏固有细胞的增殖，影响细胞间信号转导，而且可刺激细胞外大量基质合成，影响肾脏毛细血管压，从而导致肾脏结构与功能的损伤〔8〕。本实验中血脂检测结果与上述文献报道相一致。Desmin可作为光镜下足细胞损伤的标志〔9〕。在本实验中发现，甲减大鼠超微结构下足细胞足突局灶性融合，足细胞线粒体嵴部分或大部分融合或消失，部分膜融合、消失，粗面内质网有脱颗粒现象，并且这些病变随着甲减病情的加重而加重，表明甲减状态下肾小球足细胞可出现损伤，且随病程的进展而加重。与此同时，肾小球内足细胞损害标志Desmin蛋白表达也明显增高，随着甲减病程的进展，Desmin表达呈递增趋势。另外还发现，3 w时甲减组与对照组肾功能变化不明显，这表明甲减对于肾脏损伤尚处于早期阶段，也间接证明肾小球足细胞损害标志Desmin蛋白在肾损伤早期阶段即参与了疾病的发生发展过程。本结果说明肾功能损伤较甲功减低相对较晚，即当甲功减低到一定程度才开始出现肾功能损伤。B3组甲功较迅速的恢复使得肾脏损伤明显减轻(Desmin表达明显减少)，而B2组甲功较缓慢的恢复也使得肾脏损伤有所减轻(Desmin表达明显减少)，且甲状腺功能对于肾脏损伤有重要的影响，快速纠正甲功使得大鼠在肾功能、血脂、肾组织病理、Desmin表达改变方面有明显改善，较慢速纠正甲功效果好。由此可看出甲减时快速纠正甲状腺功能对于甲减的发展及甲减性肾脏损伤的预后均有比较良好的效果。
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