作者：高峰 段惠军 曹延萍 王晓梅 赵玉峰
【摘要】 目的探讨肾上腺髓质素(ADM)、内皮素-1(ET-1)及其受体在糖尿病肾病(DN)发病过程中的动态变化。方法单侧肾切除大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱发实验性糖尿病模型，大鼠随机分为对照组(A组)和糖尿病组(B组)，分别在注射STZ后第2、4和6周取材。采用免疫组化检测ADM、ET-1及其受体的表达，Western印迹检测肾上腺髓质素受体(ADMR)和内皮素受体A(EDNR-A)蛋白的表达，RT-PCR检测ADM和ET-1 mRNA的表达。结果B组较A组ADM的表达先升高后降低，ADMR、ET-1和EDNR-A表达增强。结论ADM和ET-1及其受体等血管活性物质在DN发病过程发挥着重要的作用。
【关键词】 糖尿病肾病;肾上腺髓质素;肾上腺髓质素受体;内皮素-1;内皮素受体A
糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的严重并发症之一，血流动力学改变在其中起着重要的作用。肾上腺髓质素(ADM)有明显的舒张血管、降低血压、利尿利钠、抑制细胞生长增殖等功能，在肾脏功能调节方面起着重要的保护作用。内皮素(ET)是一种具有强烈缩血管和促进细胞生长增殖作用的多肽，其中最重要是ET-1。他们都是重要的血管活性物质，在以往多 研究其在血液中的变化，在肾组织中的研究甚少，通过研究ADM和ET-1及其受体在糖尿病肾脏的表达情况，进一步探讨血管活性物质在DN中的作用机制。
1材料与方法
1.1动物模型的建立及分组选取120～150 g雄性Wistar大鼠48只(河北省实验动物中心提供)，行右肾切除术2 w后，随机分为对照组(A组)24只和糖尿病组(B组)24只。B组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(STZ)(65 mg/kg)，A组只注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液。72 h后，血糖≥16.7 mmol/L确认为糖尿病模型。实验期间动物自由进食水，不使用胰岛素及其他降糖药物。分别于注射STZ后2、4和6 w每组取6只大鼠，用代谢笼收集24 h尿，股动脉取血，用于生化指标测定，切取左肾用于各指标检测。
1.2试剂STZ(Sigma公司);兔抗ADM、肾上腺髓质素受体(ADMR)、ET-1和内皮素受体A(EDNR-A)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司);鼠抗β-actin单克隆抗体(北京中山公司);TaqDNA聚合酶(Promega公司)。
1.3引物设计ET-1：正链5′CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG G3′，负链5′AAG ATC CCAGCC AGC ATG GAG AGC G3′，产物546 bp;ADM：正链5′GGA TCC ATG AAG CTG GTT TCC ATC GC3′，负链5′GAA TTC CTA TAA CCT AGA GAC TCT GG3′，产物570 bp;GADPH：正链5′CTC TGC TCC TCC CTG TCC3′，负链5′GCC AGT AGA CTC CAC GAC AT3′，产物363 bp，引物由北京奥科生物工程公司设计合成。
1.4生化指标测定用日立7170A全自动生化分析仪测定血血清葡萄糖(Glu)、尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)、血清肌酐(Scr)和尿蛋白，并计算肌酐清除率(Ccr)。
1.5免疫组织化学检测用SP法，切片厚4 μm，常规脱蜡至水，一抗为兔抗鼠ADM、ADMR、ET-1或EDNR-A多克隆抗体(1∶100稀释)，二抗为生物素化羊抗兔IgG，DAB显色，苏木素复染，光镜观察，以细胞胞质着色呈棕黄色为阳性。
1.6Western印迹检测肾皮质ADMR和EDNR-A蛋白取肾皮质加入预冷的蛋白裂解液(2.5mmol/L EDTA，1%TritonX-100，10%甘油，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，10 mmol/L焦磷酸钠，50 mmol/L矾酸钠，1 mmol/L苯甲基磺酰氟)裂解，蛋白质定量采用Bradford法，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，加适量一抗(1∶200)，4℃过夜，洗膜后加适量辣根过氧化物酶标记的二抗，于37℃孵育2 h，DAB显色，每组重复3次，以ADMR、EDNR-A与β-actin的光密度值分别表示其相对表达量，凝胶分析软件分析结果。
1.7RT-PCR检测肾皮质ET-1和ADM mRNA的表达采用Trizol试剂提取RNA，用紫外分光光度计定量，反转录合成cDNA。PCR反应体系为25 μl，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR反应，扩增循环参数如下：94℃ 1 min，57.5℃ 1 min，72℃ 1 min，32次循环后72℃延伸8 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪中观察并扫描。
1.8统计学处理所有数据均用x±s表示，数据比较用t检验，数据统计应用SPSS统计软件完成。
2结果
2.1生化指标B组与A组相比Glu、BUN和尿蛋白增高(P<0.01)，Ccr显著降低(P<0.01)，见表1。
2.2免疫组织化学ADM和ADMR在肾小管上皮细胞及血管内皮细胞胞浆表达;ET-1和EDNR-A在肾小管上皮细胞、血管内皮细胞及肾小球细胞胞浆内均有表达。
2.3Western印迹ADMR的表达：A组ADMR的表达较弱，B组表达较A组增高，呈现逐渐增高的趋势，6 w表达最显著;EDNR-A的表达：B组较A组表达明显增强，且从2、4至6 w表达依次增强(P<0.01)，见表2，图1。
2.4RT-PCR见图2。A组ADM mRNA表达较弱，B组各期表达较A组均明显增高，4 w表达最显著，2 w和6 w时表达弱 表1各组大鼠Glu、24 h蛋白尿、BUN和内生Ccr的比较表2Western印迹检测肾皮质ADMR和EDNR-A蛋白的表达图1Western印迹检测肾皮质ADMR和EDNR-A蛋白的表达1:A组;2:2 w B组;3:4 w B组;4:6 w B组图2RT-PCR检测肾皮质ADM mRNA表达 于4 w，B组与A组相比数值分别为2 w：1.23±0.09、4 w：1.89±0.12、6w：1.57±0.07，各组差异显著(P<0.01)。ET-1 mRNA在B组各周表达显著强于A组且有逐渐增加趋势，B组与A组相比数值分别为2 w：1.19±0.13、4 w：1.37±0.12、6 w：1.54±0.09，各组间比较，差异显著(P<0.01)，见图3。1:A组;2:2 w B组;3:4 w B组;4:6 w B组图3RT-PCR检测肾皮质ET-1 mRNA表达
3讨论
ADM和降钙素基因相关肽(CGRP)有27%的相关性，属于CGRP超家族。在以往，多检测糖尿病患者血浆和尿液ADM的变化，而在肾组织中研究极少〔1〕。我们通过建立实验性糖尿病模型，发现在糖尿病早期肾组织中ADM表达明显增高，且在蛋白和mRNA水平表达一致，这可能与DN早期血流动力学改变有关，一些缩血管物质(如：AngⅡ、ET-1等)和尿蛋白的升高也可刺激ADM的生成和释放〔2〕。ADM可通过CGRP受体和/或特异的ADM受体发挥其多种生理效应，ADM可抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达，减轻胶原合成，抑制间质纤维化〔3〕。研究证实，在表现有蛋白尿的DN大鼠模型早期阶段ET-1表达增加，我们通过RT-PCR的方法进一步证实了ET-1 mRNA的表达情况，随着蛋白尿的加重，ET-1 mRNA的表达明显增加，并伴有小管间质的损害〔4〕。引起ET含量增加是多因素的，高血糖本身可刺激内皮细胞分泌ET-1，血液切应力改变引起的肾小球高滤过亦可刺激ET合成〔5〕。同时我们还通过Western印迹检测了EDNR-A蛋白的表达增强，ET-1可以通过EDNR-A诱导TGF-β1产生，并可使细胞外基质及基膜成分增多〔6〕。血管活性物质的作用非常复杂，其在糖尿病大鼠肾脏表达的异常，可能与DN发生发展有关，通过对其的深入了解，有助于探讨预防DN的发生发展的有效方法。
参考文献
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