【摘要】 目的探讨年龄对脑出血后小胶质细胞反应的影响。方法年轻(3个月龄)和老年(16个月龄)雄性S-D(Sprague-Dawley)大鼠(河南省实验动物中心提供)脑内注入100μl自体全血，观察与年龄相关的神经胶质细胞的反应。年轻、老年模型组大鼠分别在脑内注血后6、12、24、72 h、7、14 d时间点处死动物(每组6只)进行OX42免疫组化。假手术组(每组6只)作对照。观察OX42染色的阳性细胞表达。结果与年轻大鼠比较，老年大鼠脑出血后3 d有增加小胶质细胞的激活作用(OX42染色)。皮质、基底的小胶质细胞数决定其活化程度，老年大鼠在皮质、基底节有更明显的小胶质细胞活化。老年大鼠脑出血后3 d OX42阳性细胞数显著高于年轻大鼠，这种状况可持续到监测14 d(P<0.01)。结论脑出血导致老年大鼠更严重的脑损伤很可能与过度的小胶质细胞活化有关，年老是影响脑出血后脑损伤的重要因素。
【关键词】 脑出血; OX42;小胶质细胞;脑损伤;大鼠
小胶质细胞可由缺血和出血性脑卒中的损伤而活化〔1〕，变成吞噬性细胞，清除来自损伤部位的细胞碎片。然而，小胶质细胞也分泌许多类似自由基的毒性物质，可能参与脑损伤形成。有研究表明老年是影响动物及人类缺血性脑损伤的重要因素〔2，3〕。但老龄是否影响脑出血(ICH)后脑损伤，目前尚无动物模型方面的系统研究。澄清老龄ICH后脑损伤的机制有助于为ICH损伤制定新的治疗策略。
1材料与方法
1.1主要仪器、试剂Narishige型立体定向仪(日本)，微量进样器(上海医用激光仪器厂)显微外科手术器械(上海医疗器械厂)，奥林巴斯显微镜(日本)。SP免疫试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)，OX42抗体(Serotec公司)，OX42二抗(北京中杉生物技术有限公司)。
1.2实验动物与分组实验动物选自河南省实验动物中心提供的年轻3月龄和老年16月龄雄性SD大鼠，体重分别为280~350 g和600~680 g。年轻、老龄SD大鼠各42只，分别按6、12、24、72 h、7、14 d时间点及假手术组随机分组，每组6只，制作ICH动物模型，于各时间点处死动物用于免疫组织化学切片。模型组动物分别从股动脉采血100 μl，在立体定向仪 下，随机注入大鼠右侧尾状核，制作ICH模型。
1.3ICH模型建立按照包新民〔4〕等报道的定位方法，将大鼠固定在立体定向仪上，于中线右侧旁开3.5 mm右冠状缝处用牙科钻钻一直径约1 mm的小孔。模型动物用微量注射器通过26规量针(坐标距前囟点前方0.2 mm、深度5.5 mm、中线旁开3.5 mm)以10 μl/min速度向大鼠尾状核内推注100 μl未凝自体全血。退针后，骨蜡封闭钻孔，缝合切口。
1.4标本制备及OX42免疫组化大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后先用生理盐水约300 ml灌注，后用4%多聚甲醛300 ml灌注固定，断头取脑，放入4%多聚甲醛中固定6 h，固定后，石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚3 μm)，免疫组化过程严格按说明书操作。PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5阳性细胞的辨认和测定OX42为小胶质细胞的胞浆、突起着色，免疫组化阳性细胞显色为棕黄色。计数方法：对每张玻片取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，计算每高倍视野下阳性细胞均数。
1.6统计学方法应用SPSS10.0统计软件进行数据处理，所有数据均用x±s表示，采用Student t检验，取α=0.05作为显著性检验标准。
2结果
OX42阳性反应小胶质细胞：核小，胞体小，呈多形态，以球形、分枝状较多，部分呈细杆状;胞浆着色，染色呈棕黄色。在年轻组、老年组正常脑组织切片中未见OX42阳性细胞。在大鼠脑出血模型组显示，老年组活化的OX42阳性细胞明显增多，多于年轻组，易见双极分枝状细胞(细胞两极发出细长弯曲的突起，细胞核多椭圆形、偏位)和阿米巴形细胞(细胞多边形、三角形或不规则形，细长突起少，胞体大，胞浆丰富)，细胞突起增加见图1～图4。与年轻大鼠比较，老龄大鼠脑出血后72 h有增加小胶质细胞的激活作用(OX42染色)。皮质、基底的小胶质细胞数决定其活化程度，老龄大鼠在皮质、基底节区有更明显的小胶质细胞活化。见图3、图4。与年轻组比较：1)P<0.01图1同侧皮质区OX42阳性细胞数(x±s)与年轻组比较：1)P<0.01图2同侧基底节区OX42阳性细胞数(x±s)图3年轻大鼠不同时点OX42阳性细胞(×400)图4老年大鼠不同时点OX42阳性细胞(×400)
3讨论
小胶质细胞被认为是中枢神经系统内吞噬细胞，正常状态下的小胶质细胞胞体较小，具有向各个方向伸出的细胞突起，且突起细而长。静息的小胶质细胞缺乏吞噬功能，但具有吞饮功能和一定的迁移能力。当中枢神经系统损伤后小胶质细胞被激活，形态和功能发生可塑性变化〔5〕。活化的小胶质细胞突起变短，变成圆形、阿米巴状或杆状的小胶质细胞 〔6〕。小胶质细胞能表达补体受体-3(CR3)〔7〕，补体在脑出血介导脑损伤中的作用已被证实，OX42识别的受体是Ⅲ型补体受体〔8〕，Ⅲ型补体受体(CD1lb/CDl8)属于黏附分子家族，在炎症反应中介导中性粒细胞黏附于内皮细胞。脑出血后小胶质细胞活化及脑损伤的机制尚不十分清楚。Koeppen等〔9〕认为主要是血液中的血浆蛋白刺激了小胶质细胞的活化，引起小胶质细胞胞体增大，突起增多，并迅速向血肿周围迁移。Ryu等〔10〕在体外实验中发现，凝血酶刺激小胶质细胞产生NO与NF-κB。NO是具有很高毒性作用的游离基团，通过抑制含铁硫簇的酶，进而抑制氧化磷酸化，导致神经元损伤。脑出血后，大量ATP可从神经末梢，活化的免疫细胞，破坏裂解的细胞释放到胞外，并与一种细胞表面受体(P2嘌呤受体)结合，刺激小胶质细胞分泌IL-1β，TNF-α和NO等多种细胞因子〔11〕，而TNK-α又可通过活化核因子NF-κB导致小胶质细胞产生促炎症因子〔12〕的表达。在中枢神经系统中，溶血磷脂胆碱刺激小胶质细胞产生IL-1β。IL-1β可刺激小胶质细胞产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)。研究表明，腺病毒介导的IL-1β受体抗体的过度表达可使兔脑出血后脑内炎性反应和脑水肿减轻，说明脑出血后IL-1β导致了继发性脑损伤〔13〕。小胶质细胞通过产生ROS，ROS可导致膜脂质过氧化、蛋白质氧化、酶失活和DNA损伤〔14〕。在h3O2，的作用下，ROS还可转变为生物活性更强的羟自由基发挥毒性作用。 诸多证据表明炎症参与脑出血后脑损伤。脑出血引起白细胞进入脑组织及血肿周围的小胶质细胞活化〔15〕，本研究结果显示老年大鼠脑出血后同侧半球皮质和基底节区更多的小胶质细胞激活，OX42阳性细胞表达增加，明显多于年轻组大鼠。以出血后72 h表达明显增加，7 d时达高峰。我们认为针对突变的微环境，小胶质细胞的激活有其有益的一面，但持续地激活可能导致进一步的神经元损伤。激活的小胶质细胞对脑损伤是有益的还是有害的，取决于小胶质细胞激活的程度和持续时间以及小胶质细胞的作用时间点〔16〕。Lee等〔17〕用注射自体血法制作大鼠脑出血模型，小胶质细胞用异凝集素B4染色标记的实验表明，脑出血可诱导小胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变，其形态的改变、免疫显型的变化呈一定的时间依赖性，此外认为小胶质细胞活化的量与年龄也有关系。Kullberg等〔18〕对成年和老年大鼠进行小胶质细胞等的免疫组化研究，结果显示老年大鼠激活的小胶质细胞明显增多。小胶质细胞激活作用伴随人类的老龄化变得进行性的活化〔19〕。本研究显示老年大鼠脑出血后较年轻大鼠OX42阳性的小胶质细胞增加，在皮质、基底节有更明显的小胶质细胞活化，这一反应可持续至2 w。推测年老很可能是增加脑损伤的因素。但对年龄因素在脑出血介导的小胶质细胞激活中的作用是增加脑损伤的原因，或是脑损伤后的结果，需要更进一步的研究。
参考文献
1Schwartz M.Macrophages and microglia in central nervous system injury：are theyhelpful or harmful〔J〕?J Cereb Blood Flow Metab，2003;23(4):385-94.
2Davis M，Mendelow AD，Perry RH，et al.Experimental stroke and neuroprotection in the aging rat brain〔J〕.Stroke，1995;26(6):1072-8.
3Howard G，Toole JF，Frye-Pierson J，et al.Factors influencing the survivalof 451 transient ischemic attack patients〔J〕.Stroke，1987;18(3):552-7.
4包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京：人民卫生出版社，1991：197-235.
5Striet WJ，Graeber MB，Kreutzerg GW.Functional plasticity of microglia：A review〔J〕.Glia，1988;1(5)：301-7.
6Kreutzberg GW.Microglia：Asensor for pathological events in the CNS〔J〕.Trends Neurosci，1996;19(8)：312-8.
7Lu J，Moochhala S，Kaur C，et al.Cellular inflammatory response associated with breakdown of the Blood-Brain-Barrier after closed head injury in rats〔J〕.J Neurotrauma，2000;18(4)：399-408.
8Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Complement activation in the brain after experimental intracerebral hemorrhage〔J〕.J Neurosurg，2000;92(6):1016-22.
9Koeppen AH，Dickson AC，McEvoy JA.The cellular reaction to experimental intracerebral hemorrhage〔J〕.J Neurol Sci，1995;134:102-12.
10Ryu J，Pyo H，Jou I，et al.Thrombin induces NO release from cultured rat microglia via protein kinase C，mitogen-activated protein kinase，and NF-KB〔J〕.J Biol Chem，2000;275(39)：29955-9.
11Inoue K.Microglial activation by purines and pyrimidines〔J〕.Glia，2002;40(2):156-63.
12Schutze S，Wiegmann K，Machleidt T，et al.TNF-induced activation of NF-κB〔J〕.Immunobiology，1995;193(2-4):193-203.
13Stock C，Schilling T，Schwab A，et al.Lysophosphatidylcholine stimulates IL-1beta release from microglia via a P2X7 receptor-in-dependent mechanism〔J〕.J Immunol，2006;177(12):8560-8.
14Dimayuga FO，WangC，Clark JM，et al.SOD1 overexpression alters ROS productionand reduces neurotoxic inflammatory signaling in microglial cells〔J〕.J Neuroimmunol，2007;182(1/2)：89-99.
15Gong C，Hoff JT，Keep RF，et al.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat〔J〕.Brain Res，2000;871(1):57-65.
16Williams AJ，Wei HH，Dave JR，et al.Acute and delayed neuroin-flammatory response following experimental penetrating ballistic brain injury in the rat〔J〕.J Neuroinflammation，2007;4:4-17.
17Lee JC，Cho GS，Choi BO，et al.Intracerebral hemorrhage-induced brain injury is aggravated in senescence-accelerated prone mice〔J〕.Stroke，2006;37(1)：216-22.
18Kullberg S，Aldskogius H，Ulfhake B.Microglial activation，emergence of ED1-expressing cells and clusterin upregulation in the aging rat CNS，with special reference to the spinal cord〔J〕.Brain Res，2001;899(1-2)：169-86.
19Streit WJ，Sparks DL.Activation of microglia in the brains of human with heartdisease and hypercholesterohemic rabbits〔J〕.J Mol Med，1997;75(2)：130-8.