作者：龚张斌 徐品初 金国琴
【摘要】 目的观察左归丸干预皮质酮致大鼠胸腺细胞凋亡及对Bcl-2、Bax表达的影响。方法1×10-5mol/L皮质酮处理乳鼠胸腺细胞。实验分为正常对照组，模型组，左归组。Annexin V-PI双染色法结合FCM检测胸腺细胞凋亡情况;Real time PCR和Western印迹法检测Bcl-2、Bax的表达变化。结果胸腺细胞经皮质酮处理后，胸腺细胞凋亡率显著升高(P<0.01);Bcl-2 mRNA表达显著降低;Bax表达显著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)。与模型组比较，左归组胸腺细胞凋亡率降低(P<0.01);Bax mRNA表达降低，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。结论左归丸鼠血清能通过调节bcl-2/bax比率的异常变化，抑制胸腺细胞过度凋亡。
【关键词】 胸腺细胞;左归丸;凋亡;Bcl-2;Bax
【Abstract】ObjectiveTo investigate the accommodationand the molecular mechanism of Zuogui Pill(ZGP) on the apoptosis of rat thymocytes induced by corticosterone.MethodsThe ZGP contained rat serum were prepared. Thymocytes were pided into control， model， ZGP groups. The effect of apoptosis wasmeasured by Annexin V-FITC/PI double staining and FCM. The expressions of Bcl -2， Bax were measured by real-time PCR and Western blot.Results10-5 mol/L Corticosterone induced apoptosis of thymocytes，up-regulated the expression of Bax. The ratio of Bcl-2/Baxwas descended. Comparing with model group， ZGP group showed lower expression ofBax(P<0.05)， the ratio of Bcl-2/Bax was elevated. The number of apoptosis cells were decreased (P<0.05).ConclusionsZGP contained rat serum can inhibit the apoptosis of thymocytes induced by corticosterone. The possible mechanism is to regulate the ratio of Bcl-2/ Bax.
【Key words】Thymocyte; Zuogui Pill; Apoptosis; Bcl-2;Bax
免疫系统功能在衰老过程中发生进行性的下降或紊乱，表现为胸腺细胞过度凋亡，胸腺萎缩〔1〕，进而影响细胞免疫功能。左归丸方取“阳中求阴”之义，阴阳并调，具有滋阴补肾，填精益髓的功效，为治疗肾虚衰老的经典方。本课题组前期研究发现左归丸能延缓老年大鼠胸腺依赖性免疫功能〔2〕，但详细机制未明。因此本实验以衰老肾虚学说为理论依据，以阴阳平衡理论为指导，以平补肾之阴阳改善衰老机体免疫系统为立法准则，在既往整体实验基础上，模拟老年大鼠体内高皮质酮血症，制作皮质酮致胸腺细胞凋亡模型，探讨左归丸抑制胸腺细胞凋亡的分子机制。
1材料与方法
1.1材料1.1.1实验动物清洁级出生24 h SD乳鼠;清洁级成年SD大鼠，雄性，体重150～170 g。上海中医药大学实验动物中心提供〔SCXK(沪)2008-0016〕。
1.1.2主要药物和试剂左归丸：熟地24 g、山药12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、川牛膝9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、龟胶12 g，购自上海康桥药业有限公司。除鹿角胶、龟胶外，按原方比例水煎2次，浓缩，将鹿角胶、龟胶烊化，混合此三种药液，浓缩成膏，浓度2.92 g生药/g煎膏，-30℃保存。皮质酮(Corticosterone)购自US Biological公司，以二甲基亚砜(DMSO)配制成储液，-20℃冰箱保存，试验时用RPMI-1640培养基稀释(DMSO终浓度<0.5%);兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体购自Santa Cruz公司;小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酸(GAPDH)单克隆抗体购自Cell Signaling公司;Real-time PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。
1.1.3主要仪器 RealPlex4型荧光定量PCR仪(Eppendorf CO.，LTD);500型流式细胞仪(Beckman Coulter CO.，LTD)。
1.2方法
1.2.1含药鼠血清的制备选用150～170 g大鼠，分左归组和空白组，按文献方法〔3〕制备左归丸鼠血清和空白鼠血清。
1.2.2胸腺基质液的制备无菌条件下，取24 h乳鼠胸腺，按文献方法〔4〕培养胸腺基质细胞，待细胞长满培 养板孔的80%后，完全换液，继续培养48 h，收集培养上清液，0.22 μm滤器过滤，-20℃保存，备用。
1.2.3原代培养胸腺细胞取24 h乳鼠胸腺，制备胸腺单细胞悬液。应用大鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。RPMI-1640培养基稀释单细胞悬液至密度为5×106个/ml，接种于6孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱里孵育。24 h后，洗涤细胞，进行后续实验。
1.2.4 分组及药物处理正常对照组：含15%空白鼠血清;皮质酮处理组(简称模型组)：含1×10-5 mol/L皮质酮药液，15%空白鼠血清;皮质酮加左归丸血清组(简称左归组)：含1×10-5 mol/L皮质酮药液，15%左归丸鼠血清。以上各组均含40%胸腺基质液。药物处理96 h 后收集细胞，进行指标检测。
1.2.5观测指标膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色法及流式细胞仪分析： 根据试剂盒实验方法，细胞固定，染色，行流式细胞光度仪(FCM)分析。激发波长Ex=488 nm;发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过异硫氰酸荧光素(FITC)通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。每管样品检测10 000个细胞，全部数据经Beckman流式细胞仪自带软件获取和分析。Real-time PCR检测胸腺细胞各目的基因mRNA表达：Trizol Reagent抽提总RNA，合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。Bcl-2引物：上游引物：5′-TGCGCTCAGCCCTGTG-3′，下游引物：5′-GGTAGCGACGAGAGAAGTCATC-3′。Bax引物：上游引物：5′-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3′，下游引物：5′-CAATCATCCTCTGCAGCTCCATATT-3′。内参GAPDH引物：上游引物：5′-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3′，下游引物：5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCG TTCAC-3′。扩增条件：94℃变性30 s，62℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。RNA琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，取各组cDNA模板，利用Real Time-PCR检测目的mRNA的Ct值。反应体系为：2×SYBR Green PCR Master Mix12.5 μl，前向引物(10 μmol/L)1 μl，反向引物(10 μmol/L)1 μl，反转录产物(0.2 μg)5 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-ddh3O加至 25 μl，混匀，取20μl，加入PCR管中。最佳反应条件为：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 25 s，72℃ 45 s，共40个循环。每组待测样本设立6个重复，全部反应结束后，按公式：Ratio=2-△△C t︱△△Ct = 〔△Ct_Sample-△Ct_Negative Control〕计算mRNA变化值。x
【摘要】 目的观察左归丸干预皮质酮致大鼠胸腺细胞凋亡及对Bcl-2、Bax表达的影响。方法1×10-5mol/L皮质酮处理乳鼠胸腺细胞。实验分为正常对照组，模型组，左归组。Annexin V-PI双染色法结合FCM检测胸腺细胞凋亡情况;Real time PCR和Western印迹法检测Bcl-2、Bax的表达变化。结果胸腺细胞经皮质酮处理后，胸腺细胞凋亡率显著升高(P<0.01);Bcl-2 mRNA表达显著降低;Bax表达显著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)。与模型组比较，左归组胸腺细胞凋亡率降低(P<0.01);Bax mRNA表达降低，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。结论左归丸鼠血清能通过调节bcl-2/bax比率的异常变化，抑制胸腺细胞过度凋亡。
【关键词】 胸腺细胞;左归丸;凋亡;Bcl-2;Bax
【Abstract】ObjectiveTo investigate the accommodationand the molecular mechanism of Zuogui Pill(ZGP) on the apoptosis of rat thymocytes induced by corticosterone.MethodsThe ZGP contained rat serum were prepared. Thymocytes were pided into control， model， ZGP groups. The effect of apoptosis wasmeasured by Annexin V-FITC/PI double staining and FCM. The expressions of Bcl -2， Bax were measured by real-time PCR and Western blot.Results10-5 mol/L Corticosterone induced apoptosis of thymocytes，up-regulated the expression of Bax. The ratio of Bcl-2/Baxwas descended. Comparing with model group， ZGP group showed lower expression ofBax(P<0.05)， the ratio of Bcl-2/Bax was elevated. The number of apoptosis cells were decreased (P<0.05).ConclusionsZGP contained rat serum can inhibit the apoptosis of thymocytes induced by corticosterone. The possible mechanism is to regulate the ratio of Bcl-2/ Bax.
【Key words】Thymocyte; Zuogui Pill; Apoptosis; Bcl-2;Bax
免疫系统功能在衰老过程中发生进行性的下降或紊乱，表现为胸腺细胞过度凋亡，胸腺萎缩〔1〕，进而影响细胞免疫功能。左归丸方取“阳中求阴”之义，阴阳并调，具有滋阴补肾，填精益髓的功效，为治疗肾虚衰老的经典方。本课题组前期研究发现左归丸能延缓老年大鼠胸腺依赖性免疫功能〔2〕，但详细机制未明。因此本实验以衰老肾虚学说为理论依据，以阴阳平衡理论为指导，以平补肾之阴阳改善衰老机体免疫系统为立法准则，在既往整体实验基础上，模拟老年大鼠体内高皮质酮血症，制作皮质酮致胸腺细胞凋亡模型，探讨左归丸抑制胸腺细胞凋亡的分子机制。
1材料与方法
1.1材料1.1.1实验动物清洁级出生24 h SD乳鼠;清洁级成年SD大鼠，雄性，体重150～170 g。上海中医药大学实验动物中心提供〔SCXK(沪)2008-0016〕。
1.1.2主要药物和试剂左归丸：熟地24 g、山药12 g、枸杞12 g、山茱萸12 g、川牛膝9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、龟胶12 g，购自上海康桥药业有限公司。除鹿角胶、龟胶外，按原方比例水煎2次，浓缩，将鹿角胶、龟胶烊化，混合此三种药液，浓缩成膏，浓度2.92 g生药/g煎膏，-30℃保存。皮质酮(Corticosterone)购自US Biological公司，以二甲基亚砜(DMSO)配制成储液，-20℃冰箱保存，试验时用RPMI-1640培养基稀释(DMSO终浓度<0.5%);兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体购自Santa Cruz公司;小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酸(GAPDH)单克隆抗体购自Cell Signaling公司;Real-time PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。
1.1.3主要仪器 RealPlex4型荧光定量PCR仪(Eppendorf CO.，LTD);500型流式细胞仪(Beckman Coulter CO.，LTD)。
1.2方法
1.2.1含药鼠血清的制备选用150～170 g大鼠，分左归组和空白组，按文献方法〔3〕制备左归丸鼠血清和空白鼠血清。
1.2.2胸腺基质液的制备无菌条件下，取24 h乳鼠胸腺，按文献方法〔4〕培养胸腺基质细胞，待细胞长满培 养板孔的80%后，完全换液，继续培养48 h，收集培养上清液，0.22 μm滤器过滤，-20℃保存，备用。
1.2.3原代培养胸腺细胞取24 h乳鼠胸腺，制备胸腺单细胞悬液。应用大鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。RPMI-1640培养基稀释单细胞悬液至密度为5×106个/ml，接种于6孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱里孵育。24 h后，洗涤细胞，进行后续实验。
1.2.4 分组及药物处理正常对照组：含15%空白鼠血清;皮质酮处理组(简称模型组)：含1×10-5 mol/L皮质酮药液，15%空白鼠血清;皮质酮加左归丸血清组(简称左归组)：含1×10-5 mol/L皮质酮药液，15%左归丸鼠血清。以上各组均含40%胸腺基质液。药物处理96 h 后收集细胞，进行指标检测。
1.2.5观测指标膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色法及流式细胞仪分析： 根据试剂盒实验方法，细胞固定，染色，行流式细胞光度仪(FCM)分析。激发波长Ex=488 nm;发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过异硫氰酸荧光素(FITC)通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。每管样品检测10 000个细胞，全部数据经Beckman流式细胞仪自带软件获取和分析。Real-time PCR检测胸腺细胞各目的基因mRNA表达：Trizol Reagent抽提总RNA，合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。Bcl-2引物：上游引物：5′-TGCGCTCAGCCCTGTG-3′，下游引物：5′-GGTAGCGACGAGAGAAGTCATC-3′。Bax引物：上游引物：5′-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3′，下游引物：5′-CAATCATCCTCTGCAGCTCCATATT-3′。内参GAPDH引物：上游引物：5′-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3′，下游引物：5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCG TTCAC-3′。扩增条件：94℃变性30 s，62℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。RNA琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，取各组cDNA模板，利用Real Time-PCR检测目的mRNA的Ct值。反应体系为：2×SYBR Green PCR Master Mix12.5 μl，前向引物(10 μmol/L)1 μl，反向引物(10 μmol/L)1 μl，反转录产物(0.2 μg)5 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-ddh3O加至 25 μl，混匀，取20μl，加入PCR管中。最佳反应条件为：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 25 s，72℃ 45 s，共40个循环。每组待测样本设立6个重复，全部反应结束后，按公式：Ratio=2-△△C t︱△△Ct = 〔△Ct_Sample-△Ct_Negative Control〕计算mRNA变化值。
1.2.6Western印迹法检测胸腺细胞各目的蛋白表达水平收集细胞，细胞总蛋白抽提及蛋白浓度测定参照试剂盒说明。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭，加一抗，4℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗4次，二抗孵育，37℃摇床45 min，PBS漂洗4次。ECL kit检测目标条带。以GAPDH为内参，每个样本重复6次。一抗工作浓度：抗Bcl-2:1∶1 000;抗Bax：1∶1 000;抗GAPDH：1∶5 000。Western条带应用图像凝胶成像系统，灰度分析软件进行光密度计算。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值作为相应目的蛋白的表达量。
1.3统计学方法应用SPSS11.0统计软件，数据以x±s表示，采用单因素方差分析。
2结果
2.1左归丸含药鼠血清对胸腺细胞凋亡率的影响与正常对照组比较，模型组胸腺细胞凋亡率显著升高，存活细胞数量显著减少(P<0.01)。与模型组比较，左归组胸腺细胞凋亡率显著下降，存活细胞数量显著升高(P<0.01)。见表1。表1各组胸腺细胞凋亡率的变化
2.2左归丸含药鼠血清对胸腺细胞Bcl-2，Bax mRNA表达的影响与正常对照组比较，模型组胸腺细胞Bax mRNA 表达显著升高;Bcl-2 mRNA 表达及Bcl-2/Bax mRNA比值显著降低(P<0.01)。与模型组比较，左归组Bax mRNA表达显著降低(P<0.01);Bcl-2 mRNA表达无明显差异(P>0.05);而 Bcl-2/Bax mRNA比值显著升高(P<0.01)。见表2。表2各组胸腺细胞各目的基因 mRNA的变化
2.3左归丸含药鼠血清对胸腺细胞Bcl-2，Bax蛋白表达的影响与正常对照组比较，模型组胸腺细胞Bax蛋白表达显著升高(P<0.01);Bcl-2/Bax蛋白比值显著降低(P<0.01);Bcl-2蛋白表达有降低趋势(P>0.05)。与模型组比较，左归组Bcl-2蛋白表达有升高趋势;Bax 蛋白表达有降低趋势，均无统计学差异(P>0.05);但Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P<0.05)。见表3，图1。表3胸腺细胞各目的蛋白相对表达量的变化图1各组胸腺细胞目的蛋白表达结果
3讨论
衰老过程中免疫系统发生着显著且持续的衰退，胸腺萎缩、免疫功能减退是其中最显著的表现之一，称为免疫衰老。T细胞过度凋亡是免疫衰老的重要特征和原因〔5〕。衰老动物下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴虚性亢奋，糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)(在大鼠以皮质酮为主)合成病理性增高，作用于胸腺细胞，诱导细胞凋亡，组织萎缩，功能退化 〔6〕。GC诱导细胞凋亡的一个重要介质是细胞死亡调节子(Bim)蛋白，其促凋亡作用能被Bcl-2蛋白抵消。Bcl-2是第一个在淋巴细胞中被发现的能阻断细胞死亡的蛋白，可通过改变细胞周期率或通过激活抗氧化相关机制阻止细胞凋亡〔7〕。Bax属Bcl-2家族中的促凋亡成员，为线粒体膜通透的关键性效应分子〔8〕。Bcl-2蛋白能与Bax蛋白形成异二聚体，抑制后者活性，发挥抗凋亡作用。中医理论认为，肾寓真阴真阳，为一身阴阳之大主。在机体发生、生长过程中，肾中阴阳平 衡，则机体健康。阴阳失衡则致病，病害的积累又加重阴阳失衡，真阳真阴衰弱，如此恶性循环，导致机体的衰老，因此，肾阴虚衰是衰老脏腑功能失常的主要原因〔9〕，影响到神经内分泌免疫网络调节功能，致免疫功能下降。应用补肾方药提高胸腺依赖性免疫功能，是中医临床扶正固本延缓衰老的重要法则。张景岳建立左归丸，重用熟地滋填真阴，为君药，大量补阴药中，少佐补阳之品，取其“阳中求阴”之义，阴阳并调，成其“阴得阳升而源泉不竭”，奏滋阴补肾，填精益髓之效，为补肾之阴阳的经典方剂。本课题模拟胸腺细胞体内自然生长所依赖的胸腺微环境，在培养体系中添加40%胸腺基质液，进而以高浓度皮质酮进行损伤。前期试验发现，经1×10-5 mol/L皮质酮处理后，胸腺细胞白细胞介素2及其受体(IL-2/IL-2Rα)合成显著下降，而添加含左归丸鼠血清后，可以有效回调两者的合成，延缓皮质酮所致胸腺依赖性免疫功能衰退的进程〔1〕。IL-2是诱导T细胞活化的关键因子，在培养体系中添加一定浓度的IL-2能有效下降细胞凋亡率，可能与其能上调Bcl-2表达有关〔10〕。本实验进一步观察胸腺细胞的凋亡状况，发现皮质酮能明显诱导细胞凋亡，存活细胞数量显著降低。胸腺细胞经皮质酮处理后，Bax表达显著升高，Bcl-2 mRNA转录及Bcl-2/Bax比值显著降低。说明Bcl-2家族相关基因表达的改变是皮质酮诱导胸腺细胞凋亡的重要机制。采用左归丸含药鼠血清干预后，细胞凋亡率显著下降，但Bcl-2、Bax的表达变化不大，由于Bcl-2和Bax蛋白能形成二聚体，两者在细胞内的比例是调节细胞凋亡的直接相关因素之一〔11〕，进一步检测Bcl-2/Bax比值，发现皮质酮处理后，细胞表达的Bcl-2/Bax比值显著降低，而添加左归丸血清后，比值 显著提高，提示左归丸能通过调节Bcl-2/Bax之间的比率，使之趋向平衡，保护皮质酮诱导的胸腺细胞凋亡过程。左归丸是否能调节Bcl-2和Bax的亚细胞定位有待进一步研究。
参考文献
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2龚张斌，姚建平，金国琴.补肾方药对老年大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质所属组织结构形态变化的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2006;33(1)：103-4.
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