作者：张艳红 谢焕松 夏树林 赵春 谭湘陵
【摘要】 目的观察杜仲水提取物和醇提取物对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的影响。方法SD大鼠骨髓细胞体外培养并传代3次后进行成骨化诱导，诱导物分为水/醇提取物的102、103、104和105 4个稀释度。诱导6 d后，测定细胞增殖活力和细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，14 d后水溶性茜素红S染色法钙化测定结节形成。结果杜仲水/醇提取物对MSCs的增殖活力均无明显影响，对ALP活力均有上调作用。水/醇提取物在103到105稀释度下，对钙化结节的形成具有显著刺激作用，醇提取物对ALP活性和钙化结节形成的促进作用大于水提取物。结论杜仲水/醇提取物能促进骨髓MSCs成骨分化，醇提取物的作用大于水提取物。
【关键词】 杜仲;大鼠;间充质干细胞;成骨分化
骨质疏松(OP)的发病机制涉及众多方面，其中成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)的功能失调已为学术界所公认。杜仲是传统中药，具有“补益肝肾，坚筋骨，轻身耐老”的功效，已有许多学者在杜仲防治OP和调节OB等方面做了探究〔1~4〕。骨髓间充质干细胞(MSCs)是OB的来源，MSCs经过一系列过程后分化为成熟的OB。杜仲对MSCs分化影响的研究很少，目前仅有梁翔等〔5〕人的报道。杜仲有药理作用的成分很多〔6〕，并且用不同的方法提取后所得的活性成分也不相同〔7〕，但杜仲不同提取物对MSCs的直接作用尚未明了，本文应用MSCs培养体系，观察杜仲的水提取物和醇提取物对MSCs成骨 分化的影响。
1材料与方法
1.1杜仲水/醇提取物制备盐杜仲(江苏江阴天江药业有限公司，1 g/包，生产批号：070316)2 g，分别加蒸馏水或甲醇至15 ml，室温震荡1 h，静置过夜后，15 000 r/min离心10 min，弃沉淀。水浸上清不经处理即得水提取物;甲醇浸上清经真空浓缩，再加水至15 ml溶解后得醇提取物。水/醇提取物均经0.22 μm膜过滤，-20℃保存。
1.2大鼠MSCs培养2月龄SD大鼠(雌雄不拘)颈椎脱位处死，解剖取股骨和胫骨，去尽软组织后，用培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。调整细胞密度为1×105/ml后，置含20%小牛血清的DMEM/F12培养基中，在37℃、5% CO2下培养，根据细胞状况换液，细胞融合至80%左右时进行传代，传代3次后进行成骨化诱导。
1.3诱导分化实验骨髓基质细胞经计数接种到96孔和24孔培养板中，24 h后弃去原有的培养基更换诱导培养基进行实验。诱导培养基为DMEM/F12中分别含102、103、104和105 4个稀释度的杜仲水/醇提取物;对照组按照提取物的加入量加入磷酸盐缓冲液(PBS)，细胞活力实验设6个重复组，其余实验设4个重复组。
1.4MTT法测定细胞增殖活力细胞诱导分化6 d后，于96孔培养板中每孔加入20 μl MTT溶液，置37℃继续培养4 h，终止培养，吸去上清液后，每孔加入150 μl二甲基亚砜，摇床振荡10 min，溶解结晶，在ELX-800酶标仪上以490 nm波长测定各孔的吸光值。
1.5细胞碱性磷酸酶(ALP)测定细胞诱导分化6 d后取出24孔培养板，胰酶消化分别收集每孔的细胞，1 500 r/min离心5 min，去上清，用少量的PBS悬浮沉淀后，涂片。采用上海太阳生物技术有限公司ALP染色液试剂盒测定ALP活性，镜下观 察染色结果，任意视野计阳性细胞百分比，每孔至少计数1 000个细胞。
1.6细胞钙化结节测定细胞诱导14 d后，弃去24孔培养板中的培养液，PBS洗涤2次，甲醛∶甲醇∶水(1∶1∶1.5)固定15 min，1%茜素红S染色20 min，水洗若干次，室温干燥后，镜下观察每孔钙化结节的数量、体积及染色强度。
1.7统计学分析数据以x±s表示，用单因素方差分析进行组间比较。
2结果
2.1MTT法测定结果各诱导组OD490值与对照组相比无显著差异(水提物F=2.01，醇提物F=1.5，F0.05=2.76，均P> 0.05)，说明杜仲水/醇提取物对大鼠MSCs的增殖活力均无明显影响。见表1。
2.2ALP测定结果镜下ALP阳性细胞呈紫红色，阴性细胞无色。杜仲水/醇提取物对ALP活力均有上调作用，与对照组相比有极显著差异(水提物F=45.14，醇提物F=112.64，均P<0.01)，其中以醇提取物104稀释度的ALP阳性率最高。相同稀释度下，杜仲醇提取物的对ALP活性的促进作用大于水提取物，除了102稀释度外，其余同稀释度的水、醇提取物对ALP活性的影响都有统计学差异(P<0.05)。见表2。
2.3钙化结节测定结果镜下观察，对照组未见钙化结节，102稀释度的水/醇提取物钙化结节不明显。醇提取物在103、104和105稀释度下，对细胞钙化结节的形成具有显著刺激作用，水提取物在103、104和105稀释度下，也具有类似作用，但不如醇提取物明显。见图1。表1不同稀释度杜仲水/醇提物对细胞增殖的影响表2不同稀释度杜仲水/醇提物对细胞ALP活性 的影响图1钙化结节(×40)
3讨论
MSCs具有分化为多种细胞的潜能，在不同的诱导条件下可向着OB或脂肪细胞分化〔8〕，因而利用体外培养的MSCs研究促分化诱导物的作用，具有周期短、操作简便、重复性好和结果可靠的特点。本研究发现，杜仲水/醇提取物对细胞的增殖活力并无刺激作用，结果与王大为成骨样细胞的研究报道〔4〕不同，可能与实验细胞不同有关。ALP是MSCs向成骨细胞分化的早期表达标志性酶，它的活性检测是鉴定成骨细胞的主要方法，本研究发现，杜仲水/醇提取物能显著提高细胞内ALP的表达，证实杜仲对MSCs的成骨分化具有明显的促进作用。钙化结节是OB分泌的胶原亲合钙盐而成，是OB分化成熟的重要标志，杜仲水/醇提取物也对细胞钙化结节的形成具有显著的刺激作用。无论是对ALP的活性还是钙化结节的形成 ，都表现出醇提取物的作用大于水提取物，说明杜仲中成骨的诱导物在醇提取物中的含量大于水提取物，结果与梁翔以血清作为杜仲不同提取物的载体对MSCs分化影响的结果是一致的〔5〕。低稀释度(102)杜仲水/醇提取物能显著促进ALP活性而对钙化结节的诱导作用不明显，提示诱导ALP表达的成分与诱导钙化结节的成分不可能有所同，或二者的最佳 诱导浓度不同。本文研究证实了杜仲防治OP的机制之一是促进诱导MSCs的成骨分化，同时本文不同提取方法所得产物活性存在差异的结果，也为进一步提取分离杜仲有效组分提供资料。
参考文献
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