【摘要】 目的观测基质金属蛋白酶(MMP)中的MMP-2、MMP-9及其抑制因子(TIMP-1)在db/db自发性2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺中的表达情况及意义。方法用免疫组织化学方法观察db/db小鼠胰腺中MMP-2、MMP-9、TIMP-1在小鼠胰腺的表达水平。结果MMP-2、MMP-9阳性反应产物主要位于胰岛细胞胞浆内，随着月龄的增加糖尿病和正常组的表达均增强。 糖尿病组间比较，有显著性差异(P<0.05)。 正常组间比较，无显著性差异(P>0.05)。同月龄糖尿病组的表达明显高于正常组，有显著性差异(P<0.05)。TIMP-1阳性反应产物位于胰岛细胞胞浆内，糖尿病组与正常组随着月龄的增加，表达均减弱，糖尿组间无显著性差异(P>0.05)。正常组间比较，无显著性差异(P>0.05)。同月龄糖尿病组与正常组间比较，糖尿病组的表达明显低于正常组，有显著性差异(P<0.05)。结论2型糖尿病的发生可能与MMPs/TIMP-1s系统的调控失衡密切相关。
【关键词】 糖尿病;胰腺;MMP-2;MMP-9;TIMP-1
2型糖尿病(T2DM)约占糖尿病病人的90%以上，其病因和发病机制尚未完全阐明。细胞外基质(ECM)是胰岛细胞微环境中的重要组成成分，与胰岛细胞的活力和功能密切相关〔1〕。ECM 的重塑、合成与降解失衡，最终导致EM积聚是许多疾病发展至终末期的共同途径〔2〕。基质金属蛋白酶(MMP)与糖尿病的关系的研究受到了广大学者的重视，研究重点多为MMPs及其抑制因子(TIMPs)与糖尿病血管病变、糖尿病肾病等并发症的关系。对MMPs 、TIMPs在糖尿病胰腺中的表达情况未见报道。本研究以遗传性肥胖性T2DM动物模型db/db小鼠为研究对象，此模型为T2DM的良好模型。应用免疫组化方法探讨T2DM小鼠胰腺中基质金属蛋白酶中的MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1的表达变化，并阐明上述因子与T2DM发病的关系，希望为进一步探讨T2DM的发病机制提供理论依据。
1资料与方法
1.1动物来源及分组引进日本C57bl/Ksj-db/+m转基因小鼠，近亲(兄妹)交配。db/+m型为糖尿病和肥胖基因携带者，其表型正常，后代中雌雄纯合子个体发生糖尿病和肥胖，即db/db型。病例组分别选取3，5，8，10，12月龄db/db自发性糖尿病小鼠每组6只。对照组选取相应年龄段db/+m表型正常小鼠，每组6只。分组标准：表型糖尿病小鼠均发生明显肥胖。血糖>10 mmol/L定为糖尿病。
1.2试剂来源一抗MMP-2、MMP-9、TIMP-1(兔抗鼠IgG多克隆抗体)，SP试剂盒及DAB显色剂均购于北京中山生物技术有限公司(Santa Cruz公司产品)。
1.3血糖测定断尾取血，并用美国强生微型血糖仪测定血糖值。
1.4制作切片将用于光镜的小鼠胰尾标本固定于4%多聚甲醛。组织块经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片，厚度为6 μm，每隔30张取7片蜡带分别裱于有 APES的载玻片上。
1.5免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L PBS 清洗，0.3%甲醇-过氧化氢室温下孵育，蒸馏水清洗。0.1 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内修复，10%山羊血清，37℃温箱湿盒内孵育后，滤纸吸去多余血清，加入一抗(兔抗鼠MMP-2 1∶100;兔抗鼠 MMP-9 1∶100;兔抗鼠TIMP-1 1∶100)。0.01 mol/L PBS清洗3次。滴加生物素化二抗(山羊抗兔)工作液，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，37℃温箱湿盒内孵育。PBS 清洗，DAB显色，苏木精复染细胞核。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上。
1.6阳性细胞图像分析所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在相同的放大倍数下(400倍)，每个年龄段计数6只小鼠的胰腺，每个标本取3张切片，每个切片取10个视野。 所有指标以阳性细胞染色的平均光密度值(OD值)来表示抗原表达量。
1.7统计学分析用SPSS11.0软件包，集中趋势及离散趋势用x±s描述，多组间比较用单因素设计的方差分析，单因素两组间比较用t检验，两两比较用q检验。
2结果
2.1免疫组织化学MMP-2阳性细胞OD值MMP-2阳性反应产物主要位于胰岛细胞胞浆内，呈棕黄色。糖尿病组各月龄OD值均数在0.222 7~0.323 0之间，随着月龄的增加表达明显增强，至12月龄小鼠胰腺中表达最强。糖尿病组间比较，有显著性差异(P<0.05)。糖尿病组间两两比较。除外10月和12月间，其他各组间比较均有显著性差异(P<0.05)。正常组各月龄OD值均数在0.115 7~0.141 5之间，随着月龄的增加表达增强，正常组间比较，无显著性差异(P>0.05)。同月龄糖尿病组与正常组比较表达明显增强，有显著性差异(P<0.05)，见图1，表1。
2.2免疫组织化学MMP-9阳性细胞OD值MMP-9阳性反应产物位于胰岛细胞胞浆内，呈棕黄色，正常组和糖尿病组均显示胰岛周边细胞表达较强。糖尿病各月龄OD值均数在0.192 4~0.2886之间，随着月龄的增加表达增强，12月龄小鼠胰腺表达最强。糖尿组间比较，有显著性差异(P<0.05)，糖尿病组间两两比较结果：除外8月和10月间，其他各组间比较有显著性差异(P<0.05)。正常组各月龄OD值均数在0.094 5~0.115 1之间，随着月龄的增加表达增强，正常组间比较，无显著性差异(P>0.05)。同月龄糖尿病组与正常组比较表达明显增强，有显著性差异(P<0.05)，见图2，表2。
2.3免疫组织化学TIMP-1阳性细胞OD值TIMP-1阳性反应产物位于胰岛细胞胞浆内，呈棕黄色。糖尿病各月龄OD值均数在0.117 5~0.105 4之间，3月龄小鼠胰腺表达最强，随着月龄的增加表达减弱，12月龄表达最弱，糖尿组间比较，无显著性差异(P>0.05)。正常组各月龄OD值均数在0.262 1~0.226 0之间，3月份胰腺表达最强，随着月龄的增加表达减弱，12月 龄表达最弱，正常组间比较，无显著性差异(P>0.05)。同月龄糖尿病组与正常组比较表达明显减弱，有显著性差异(P<0.05)，见图3，表3。图13月及10月龄小鼠胰岛中MMP-2表达(DAB，×400 )图23月及10月龄小鼠胰岛中MMP-9表达(DAB，×400 )图33月及10月龄小鼠胰岛中TIMP-1表达(DAB，×400 )表1糖尿病组与正常组胰岛β细胞中MMP-2阳性细胞平均OD值表2糖尿病组与正常组胰岛β细胞中MMP-9阳性细胞平均OD值表3糖尿病组与正常组胰岛β细胞中TIMP-1阳性细胞平均OD值
3讨论
ECM降解、重塑不仅是机体正常生长发育的一个重要生理特征，而且在多种疾病的发生发展过程中扮演重要角色。ECM 的重塑、合成与降解失衡，最终导致ECM积聚是许多疾病发展至终末期的共同途径〔2〕。MMPs及其TIMPs在ECM的代谢中起重要作用，其代谢紊乱，可以引起糖尿病、肝硬化、肿瘤等多种疾病，MMPs不仅参与ECM代谢的调控，在疾病状态下ECM 的重塑中也起着重要作用，并且与活动性炎症有一定关系〔3〕。 本研究应用免疫组化法测得MMP-2、MMP-9在T2DM db/db小鼠胰岛中的表达与db/+m型正常小鼠相比明显增强，而其抑制因子TIMP-1的表达则减弱。糖尿病小鼠胰腺的病理变化随着病程的延长胰腺的纤维化程度加重，说明ECM的积聚加重，本实验结果对ECM有降解作用的MMPs表达增强，即MMPs的活化水平增强和纤维化同时存在，可能为糖尿病时胰腺纤维化加重的代偿反应。这一现象在李玉明〔4〕MMP与高血压肾纤维化研究进展中有类似报道，与Wistar大鼠相比，自发性高血压大鼠(SHR)的MMPs活性明显升高。
TIMP-1在糖尿病小鼠胰腺中的表达减弱支持了糖尿病时胰腺纤维化加重的病理变化。本实验中的TIMP-1在糖尿病小鼠胰岛中表达下调。另外，TIMP-1直接抑制MMP-9，其在糖尿病小鼠胰岛中表达下调与MMP-9表达水平升高的结果相一致。总之，糖尿病是一个多因素的病理过程，MMPs的分泌和调控也是一个复杂的网络系统，明胶酶MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1在T2DM db/db小鼠胰岛中的表达和活性的异常说明其在糖尿病小鼠的发生发展中起重要作用，有助于进一步阐明T2DM的发病机制。对MMPs/TIMP-1s系统平衡的调控或使用人工合成基质金属蛋白酶及其抑制因子等手段进行干预，有望为糖尿病的治疗开辟新的途径。
参考文献
1张旭辉，王常勇，郭希民，等.不同种类细胞外基质材料对胰岛细胞活力和功能的影响〔J〕.解放军医学杂，2004;29(2):124.
2Arthur MJ.Fibrosis and altered matrix degradation〔J〕.Digestion，1998;59(10):376-80.
3赵慧颖，黄雯.基质金属蛋白酶与肾脏疾病〔J〕.北京医学，2005;27(8):505.
4李玉明，姚旻.基质金属蛋白酶与高血压肾纤维化研究进展〔J〕.心血管病进展，2006;27(1):101-2.