顺铂联合exosomes抗小鼠肝癌效应的实验研究

　　　　 作者：汪少华， 沈宜*， 李静， 向自武， 范维珂， 陈黎

【摘要】 　　目的: 评价顺铂(DDP)与exosomes联用的抗肿瘤效果， 研究其可能机制。方法: 采用MTT法检测顺铂对小鼠肝癌h32细胞增殖的影响， 用h32源exosomes瘤苗免疫小鼠， 3HTdR释放法检测exosomes诱导产生的CTL活性及顺铂对CTL杀伤的增敏作用， RTPCR检测顺铂作用后h32细胞中Fas及exosomes免疫后脾淋巴细胞FasL的mRNA表达水平， Western blot检测顺铂对h32细胞Fas的蛋白表达水平的影响。以小鼠肝癌h32细胞接种BALB/c小鼠建立动物模型， 观察顺铂联合exosomes治疗对小鼠生存期的影响。结果: 顺铂抑制h32细胞生长呈量效关系; exosomes免疫小鼠可诱导产生针对h32细胞的CTL反应， 经2.5 mg/L顺铂预处理24 h的h32细胞对CTL杀伤的敏感性增强（P&<0.05）。顺铂在mRNA和蛋白水平， 显著增强h32 Fas的表达; exosomes免疫小鼠后， 脾淋巴细胞FasL表达增加。顺铂联合exosomes组小鼠生存期较单独治疗组及对照组明显延长（P&<0.05）。结论: 顺铂与exosomes联合治疗有协同抑制肿瘤的作用， 产生协同作用的机制与增强CTL活性有关。

【关键词】 顺铂; exosomes; 联合治疗; 肿瘤疫苗

　　［Abstract］ AIM: To study the antitumor effects and mechanisms of cisplatin(DDP) combined with exosomes. METHODS: The cellgrowth inhibition of DDP on h32 ce11s was analyzed by MTT assay．The mice were immunized by h32 cellderived exosomes. The exosomes elicited CTLspecific cytotoxicity and DDP enhanced cytotoxicity in combination with CTL were detected by 3HTdR release assay. The effect of DDP on mRNA and protein levels of Fas in h32 was analyzed using RTPCR and Western blot.The expression of FasL on spleen lymphocyte was determined by RTPCR. BALB/c mice inoculated with hepatoma carcinoma cell line h32 were used as tumor models.The mice received exosomes solely or in combination with DDP.The survival of the mice was observed. RESULTS: DDP inhibited h32 cell in a dosedependant manner. The exosomes elicited CTLspecific cytotoxicity was enhanced by DDP（P&<0.05）. RTPCR and Western blot showed Fas increased gradually after administering DDP on h32 cells.RTPCR also indicated the mRNA level of FasL on mice spleen lymphocyte increased after immunized by exosomes. Compared with other groups， the combination group(DDP plus exosomes)could statistically prolong the survival time（P&<0.05）. CONCLUSION: The therapy of DDP combined with exosomes had significant synergistic effect against tumor. The mechanism of synergistic effect includes enhancement of CTL activity.

　　［Keywords］cisplatin; exosomes; combination therapy; cancer vaccine

　　Exosomes是由多种活细胞分泌的来源于多囊体的膜被囊泡， 具有独特的蛋白质和脂质成分， 是近年来肿瘤学研究的一个热点。肿瘤细胞源exosome(TEXs)具有自身的特点， 其承载着一套肿瘤的共同抗原， 并富含热休克蛋白(heatshock proteins， Hsp)7090， MHCI类分子等， 有希望成为一种新的亚细胞肿瘤疫苗［1， 2］。但是单一的exosomes瘤苗疗效有限， 与化疗联合应用能否进一步增强治疗效果， 是我们希望了解的问题。因此我们采用化疗药顺铂(Cisplatin， DDP)联合自行提取的h32源的exosomes瘤苗作用于小鼠肝癌， 以探讨二者是否具有抗肿瘤作用的协同效应及可能机制， 从而为肿瘤疫苗的临床应用、 治疗方案的优化等积累资料， 最终为临床开展化疗联合肿瘤疫苗的免疫治疗提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 小鼠肝癌细胞株（h32）由本教研室提供。BALB/c小鼠（H2d）， 雌性， 6～8周龄， （18～22）g， 购于重庆医科大学实验动物中心。参照文献［3］自行提取小鼠肝癌细胞（h32）源的exosomes瘤苗。小鼠淋巴细胞分离液购自天津TBD公司。顺铂为山东德州制药厂产。Hoechest 33258购自凯基生物科技发展有限公司。兔抗鼠Fas、 βactin抗体和山羊抗兔多克隆二抗购自北京中杉公司。TRIzol试剂为Invitrogene公司产品。 cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司。PCR扩增试剂盒购自Galen公司。3HTdR购于中国原子能科学研究院。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法检测顺铂对小鼠肝癌h32细胞的抑制作用 用培养液将对数生长期的h32细胞配制成5×107个/L的细胞悬液， 每孔200 μL加入96孔培养板内。实验设肿瘤细胞阴性对照组及5个不同浓度的药物实验组（2.5、 5、 10、 20、 40 mg/L）， 每个剂量5个平行孔。在37℃ 、 50 mL/L CO2孵箱内培24 h后取出离心， 吸弃上清， 每孔加无血清RPMI1640 200 μL， MTT(5 g/L) 20 μL， 再培养4 h， 离心、 弃上清。每孔加二甲亚砜(DMSO) 200 μL， 测得每孔A570值。药物作用效应即抑制率=（1-实验组A值/对照组A 值)×100%。

　　1.2.2 脾细胞中特异性CTL杀伤实验 ①免疫小鼠: 取5只BALB/c小鼠于左后腿皮下注射h32肿瘤细胞源exosomes 10 μg/次。共免疫3次， 每间隔1 d重复1次; ②效应细胞的制备: 最后1次免疫后第7天， 利用密度梯度离心法采集小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞; ③靶细胞制备: 取对数生长期的h32细胞和经顺铂（抑制率低的浓度: 2.5 mg/L）预处理24 h的h32细胞为靶细胞; ④特异性CTL杀伤活性检测: 参照文献［4］采用3HTdR释放法测定exosomes瘤苗诱导产生的特异性CTL活性， 效靶比(E∶T)设10∶1、 20∶1、 40∶1、 80∶1， 按以下公式计算特异性CTL细胞杀伤活性: CTL细胞杀伤活性＝(1-实验孔cpm/自发释放孔cpm)×100%。

　　1.2.3 RTPCR检测顺铂对h32细胞Fas和exosomes对脾淋巴细胞FasLmRNA表达的影响 用TRIzol法分别提取经0、 2.5、 5 mg/L顺铂作用24 h的h32细胞总RNA和exosomes免疫前后的脾淋巴细胞总RNA。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 测样品A260/A280比值后， 行RTPCR。所有基因的引物及扩增长度大小见表1。反应条件为: 94℃预变性5 min， 94℃变性30 s， 56℃（Fas和βactin）或60℃（FasL）退火30 s， 72℃延伸1 min， 30个循环， 72℃延伸10 min。取5 μL作20 g/L琼脂糖凝胶电泳， 使用Quantity One图象分析系统分析结果， 目标mRNA的表达量使用内参照βactin进行校正。

　　表1 各引物序列及产物长度（略）

　　Tab 1 Primer sequences and fragment

　　1.2.4 Western blot检测顺铂对h32细胞Fas蛋白表达的影响 收集以上经0、 2.5、 5 mg/L顺铂作用24 h的h32细胞， 加入细胞裂解液， 冰上裂解30 min， 12 000 r/min离心30 min， 取上清， Bradford法定量后置-80℃备用。灌制100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶， 常规电泳， 转膜， 封闭， 一抗(1∶500)， 4℃孵育过夜， 二抗(1∶5 000)， 室温孵育2 h， ECL显色后曝光显影。结果使用Quantity One图象分析系统进行光密度值分析， 目标蛋白表达量使用βactin进行较正。

　　1.2.5 顺铂联合exosomes对荷瘤鼠生存期的影响 24只BALB/c小鼠右腋皮下分别接种h32细胞1×106个/只， 复制肿瘤模型， 随机分为4组。对照组: 荷瘤小鼠腹腔只注射生理盐水; Exosomes组: 肿瘤细胞接种当天， 于小鼠腿根部皮下注射h32源exosomes(10 μg/只) ， 每间隔1 d重复1次， 共3次; 化疗组: 瘤细胞接种当天， 于小鼠腹腔注射2 mg/kg顺铂（小鼠顺铂的最大耐受剂量为9 mg/kg）; 联合组: 肿瘤细胞接种当天， 于小鼠腹腔注射2 mg/kg顺铂， 3 d后皮下注射h32源exosomes (10 μg/只)， 每间隔1 d重复1次， 共3次(预实验结果显示顺铂化疗3 d后为疫苗接种的最佳时期)。观察小鼠生存情况， 记录生存时间。实验动物生存时间以各组小鼠治疗后开始计算。

　　1.2.6 统计学分析 所得数据用SPSS10.0、 Excel软件分析作图， 多组间均数比较采用单因素方差分析， 两组间均数比较采用LSDt检验， P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 药物作用动力学 MTT抑制率实验显示， 顺铂在实验药物浓度下对小鼠肝癌h32细胞的生长均有抑制作用， 其抑制作用随浓度的增加而增大， 呈剂量效应依赖性（图1）。

　　图1 MTT法示不同浓度顺铂抑制h32细胞的量效关系（略）

　　Fig 1 Inhibiting efects of DDP on the proliferation of h32 cells in dose dependant manner

　　2.2 小鼠脾细胞特异性CTL活性 细胞毒活性随效靶比的上升而逐渐提高， 低浓度顺铂（2.5 mg/L）预处理24 h后的h32细胞对CTL反应敏感性增强， 在效靶比为10∶1、 20∶1、 40∶1、 80∶1时的杀伤率分别高于单独CTL组， 顺铂增强了CTL的杀伤效应。同一效靶比两组间均有统计学意义（P＜0.05， 图2）。

　　图2 Exosomes诱导的CTL细胞毒活性（略）

　　Fig 2 Cell mediated cytotoxicity of the exosomes elicited CTL

　　2.3 顺铂对h32细胞Fas表达的影响 半定量RTPCR和Western blot检测结果显示， 顺铂显著上调Fas基因及蛋白的表达， 经2.5 mg/L和5 mg/L顺铂作用24 h后， h32细胞Fas mRNA水平分别升高3.1倍和4.9倍; Fas蛋白水平分别升高3.3倍和5.1倍(图3， 表2)。

　　图3 顺铂对h32细胞Fas mRNA 和蛋白表达水平的影响（略）

　　Fig 3 Effects of cisplatin on Fas mRNA and protein levels in h32

　　A: Fas gene; B: Fas protein. M: DL 2 000 marker; 1: Control; 2: 2.5 mg/L DDP; 3: 5 mg/L DDP.

　　表2 顺铂对h32细胞Fas mRNA 和蛋白表达水平的影响（略）

　　Tab 2 Effects of cisplatin on Fas mRNA and protein levels in h32(band density analysis， n=6， x±s)

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.4 Exosomes免疫对小鼠脾淋巴细胞中FasL表达的影响 RTPCR结果显示， exosomes免疫后的脾淋巴细胞中， 能扩增出在456 bp的特异性目的条带， 免疫前的对照组脾淋巴细胞未见扩增出FasL的目的基因条带（图4）。

　　图4 Exosomes对脾细胞FasL转录水平的影响（略）

　　Fig 4 Effects of exosomes on FasL mRNA level in spleen lymphocyte

　　A: M: DL 2 000 marker; 1: Control; 2: Exosomes immunized spleen lymphocyte. B: Band density analysis. aP＜0.05 vs control group.

　　2．5 顺铂与exosomes联合应用对小鼠生存期的影响 各组平均生存时间见表3， 联合治疗明显提高了荷瘤鼠的生存时间， DDP+exosomes联合治疗组、 DDP组、 exosomes组、 对照组荷瘤小鼠平均生存期分别为(58.2±11.8) d、 (31.5±6.6) d、 (29.5±7.9) d、 (18.7±2.1) d。联合治疗组荷瘤小鼠平均生存期显著长于DDP组和exosomes组(P＜0.05)， DDP组、 exosomes组与对照组比较也有统计学意义(P＜0.05)。

　　表3 各组小鼠平均存活时间（略）
　　
　　Tab 3 Mean survival times of mice in each group

　　aP＜0.05 vs control group; cP＜0.05 vs DDP+exosomes group.

　　3 讨论
　　
　　肿瘤免疫治疗的理想疫苗应具备安全、 有效、 稳定等生物学特征。Exosomes作为一种新型的非细胞疫苗， 其理化性质、 生物学特性均符合上述要求［5］。肿瘤来源的exosomes富含HSP7090分子伴侣、 肿瘤共同抗原， 是一种新型的肿瘤排斥抗原来源， 引起了人们广泛的的兴趣［6］。 最近， 大量的研究报道， exosomes能有效地诱导特异性的CTL细胞， 引发有效的免疫应答， 从而杀伤肿瘤细胞［7， 8］。 Fas/FasL途径是CTL杀伤靶细胞的两条主要途径之一， 某些癌细胞通过Fas分子表达缺陷， 来抵制FasL介导的细胞凋亡， 并逃避免疫攻击， 使exosomes瘤苗的疗效受影响， 因此仅仅exosomes自身的免疫调节作用是有限的。
　　
　　为了进一步提高exosomes的抗肿瘤效力， 实验中我们将上述h32细胞来源的exosomes作为肿瘤疫苗， 与顺铂联合使用， 观察二者的联合使用能否起到协同的抗肿瘤作用。首先， 我们取exosomes免疫后的脾淋巴细胞作为效应细胞， 以h32细胞和2.5　　mg/L顺铂预处理过后的h32细胞作为靶细胞进行脾淋巴细胞中特异性CTL杀伤实验。结果显示， exosomes免疫后的小鼠脾CTL细胞可杀伤h32肿瘤细胞， 且经顺铂作用24 h后的h32细胞对该小鼠脾CTL细胞敏感性增强， 脾CTL细胞杀伤活性显著升高（P＜0.05）。为了进一步研究联合治疗产生协同作用的机制， 以设计更加合理的联合方案， 本实验对其内部机制进行了初步探讨。研究发现， 小鼠肝癌h32细胞经顺铂处理24 h后， Fas在h32肿瘤细胞mRNA和蛋白表达水平都大幅度增加， 而且经exosomes免疫后的小鼠脾淋巴细胞FasL高表达， 这样可与靶细胞表面Fas结合， 更大限度地诱导肿瘤细胞凋亡， 提示FasLFas可能是顺铂与exosomes诱导产生的CTL发挥协同杀伤效应的机制之一。
　　
　　其次， 采用化疗药顺铂作为辅助， 我们在体内实验中， 进一步证明其是否可增强exosomes瘤苗的效果。结果显示: 顺铂和exosomes单独使用， 均有一定的抗肿瘤效应， 可延长荷瘤小鼠生存期， 而且顺铂与exosomes瘤苗联合应用组小鼠的生存期较之单独顺铂或exosomes瘤苗治疗组明显延长（P＜0.05）。该结果显示顺铂和exosomes联合治疗小鼠肝癌皮下移植瘤的实验中产生了协同作用， 结合体外实验， 分析其可能作用机制: ①化疗药顺铂可诱导肿瘤细胞表面Fas表达增加， exosomes免疫后的小鼠脾CTL细胞FasL高表达， 联合应用可更大限度地诱导肿瘤细胞凋亡。Lacour等［9］的研究中也发现顺铂可以使Fas成簇分布在细胞膜上。②化疗药顺铂通过抑制肿瘤细胞增殖， 控制了肿瘤进展， 从而为exosomes诱导肿瘤特异性CTL细胞的大量增殖提供了充分的时间。③本实验在化疗药顺铂对机体T细胞产生抑制作用后的恢复期注射exosomes瘤苗， 机体处于T细胞数量减少的状态下， 疫苗更有效介导特异性CTL细胞增殖， 从而更有效地增强机体抗肿瘤免疫作用［9］。④化疗药物顺铂可通过抑制肿瘤细胞DNA、 RNA的合成， 直接杀伤肿瘤细胞， 增加肿瘤抗原释放， 这可促使肿瘤组织内的APCs负载更多的肿瘤抗原， 并给瘤内的CTL细胞增殖提供协同刺激信号， 使exosomes诱导产生的CTL有效地发挥效应。但是化疗联合肿瘤疫苗也可能存在问题， 因为化疗除了直接杀伤肿瘤细胞以外， 也可以抑制机体免疫系统， 因而可能削弱肿瘤疫苗的免疫治疗效果， 因此有作者认为在化疗联合免疫治疗肿瘤的实施中， 选择合适化疗药物剂量［11］和最佳的时间间隔［12］是非常重要的。
　　
　　本实验初步证实， 化疗药顺铂与exosomes联合应用对小鼠肝癌有协同作用， 抗肿瘤效应明显增强， 实验动物未出现明显不良反应， 提示联合疗法有很好的应用前景。肿瘤治疗往往是多种手段的综合治疗， 本研究为临床联合应用化疗和肿瘤免疫生物治疗提供了实验依据， 值得进一步深入研究。

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