全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

　　　　 作者：黄建， 肖艳， 童永清， 郭锋杰， 周国华， 李跃辉， 胡锦跃， 李官成

【摘要】 　　目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库， 从中筛选抗肝癌单链抗体（scFv）， 并对其特异性进行鉴定。方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库。对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选， 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库。对抗体库进行3轮正负淘选和富集后， 随机挑取2798个克隆进行ELISA， 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应， 而与QSG7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应。对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定， 结果与ELISA一致。免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义。结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库。通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆， 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础。

【关键词】 EB病毒转化 噬菌体抗体库 肝肿瘤 单链抗体

　　[Abstract] AIM: To construct a fully human antihepatoma singlechain phage antibody library， select the antihepatoma scFv from it and identify its characteristics. METHODS: A fully human scFvdisplaying phage library was constructed by using phage antibody library technique in combination with in vitro immunization and EBV transformation. The library was subjected to three rounds of positive and negative cell panning and enrichment and then it was selected by ELISA. The binding specificity of phage antibodies with hepatoma carcinoma cells was confirmed by immunohistochemistry. RESULTS: After scFv genes being cloned into vector Fuse5 and transformed into E.coli MC1061 via electroporation， a phage antibody library containing 1.0×108 TU (transduced unit) was obtained through tetracyclineresistant screening. After panning， enrichment and testing by ELISA， 3 phage antibody clones reacting more strongly to HepG2 than QSG7701 were picked out of 2798 clones. One clone， SA3， was further analysed after DNA sequencing. The results of immunohistochemistry with cultured cells were similar to those of ELISA. SA3 reacted specifically to hepatoma cells in most human hepatoma tissue sections but in few human normal liver tissue sections. The distinction of positive rates is of a great statistical significance. CONCLUSION: A fully human antihepatoma scFv fusion phage library has been constructed. ELISA and immunohistochemistry results conform SA3 specifically bind with hepatoma carcinoma cells. The scFv fragment against hepatoma may be further developed and applied in clinical diagnosis and therapy of liver cancer.

　　[Keywords]EBV immortalization; phage antibody library; hepatoma; scFv

　　肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤， 是我国和亚洲地区的常见病和多发病， 病死率居恶性肿瘤的第3位[1]。肝癌90%以上为原发性， 发病隐匿， 发现时多数已处于中晚期， 丧失了手术时机。目前的化疗药物由于缺乏肝癌细胞特异性而具有明显的副作用。单克隆抗体（mAb）以其特异靶向性在放射免疫诊断和导向治疗方面有较大的应用价值， 但其作为鼠源蛋白容易引起机体排斥反应，限制了它的临床应用。噬菌体抗体库技术的出现并发展成熟使获得人源小分子抗体成为可能[2]， 它克服了mAb制备时效率低、 杂交瘤体外培养不稳定等缺点， 便于筛选针对多种抗原的抗体， 而且可以直接获得抗体的基因序列， 可以方便的通过基因工程手段进行改造并大量生产。为提高筛选到特异性抗体的几率， 我们实验室创立了体外致敏和EBV (EpsteinBarr virus， EBV)转化技术联合噬菌体展示技术构建全人源噬菌体抗体库的技术[3， 4]， 并筛选到了特异性抗体。本研究我们即从利用此方法构建的抗肝癌人源单链抗体库中筛选出抗肝癌细胞单链抗体(scFv)， 为肝癌的诊断和治疗奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 丝状噬菌体Fuse5， 大肠杆菌菌株K91Kan， 肝癌细胞系HepG2， 肝细胞系QSG7701， 脐静脉内皮细胞系HUVEC均由本室保存。小牛血清(NBS)为杭州四季青公司产品。高糖DMEM、 琼脂糖和细菌培养基购自Gibco/BRL公司。cDNA合成试剂盒， Sfi I限制性内切酶， Pfu DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司。质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司。HRP标记的鼠抗M13 mAb（HRP/antiM13 Monoclonal Conjugate， HRP/antiM13）购自Pharmacia Biotech公司。20份肝癌患者（病理检查确诊）外周血标本采自湖南省肿瘤医院和湘雅二医院， 术前1 d采血。43例肝癌组织石蜡切片由中南大学湘雅医院、 湘雅二医院病理科提供， 12例肝组织（非肿瘤组织）石蜡切片由湖南省人民医院病理科提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞常规培养 各种细胞系均用含100 mL/L NBS的高糖DMEM培养基在37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养。

　　1.2.2 噬菌体单链抗体库的构建 从肝癌患者外周血分离单个核细胞(PBMC)后用肝癌细胞HepG2抗原进行体外致敏和EBV转化。抽提转化后B细胞总RNA并逆转录合成cDNA第1链， 以此为模板扩增抗体可变区基因并连接成scFv， 继而克隆入载体Fuse5构建噬菌体单链抗体库。具体实验操作

参考文献

[3， 4]进行。

　　1.2.3 噬菌体抗体库的富集淘选 取抗体库1 mL(含1011 TU(转化单位))用10 g/L BSA（牛血清白蛋白）溶液稀释至2 mL， 在37℃依次与2瓶QSG7701细胞各孵育1 h， 得到递减的噬菌体上清; 将递减上清与肝癌细胞HepG2在37℃孵育1 h; 弃上清，　　 用含0.5 mL/L Tween20的PBS(磷酸盐缓冲液)（PBST）冲洗细胞10次后加入2 mL Ebuffer（BSA 1 g/L， 甘氨酸6.2 g/L， ph3.2）， 室温下作用10 min洗脱噬菌体， 之后用0.375 mL Nbuffer（1 mol/L TrisHCL pH9.1）中和; 洗脱的噬菌体抗体感染大肠杆菌K91Kan并铺到含四环素(40 mg/L)的LB琼脂糖平板上， 37℃培养16 h以扩增噬菌体; 扩增的噬菌体用200 g/L PEG8000/NaCl沉淀后溶于0.02 mol/L PBS即为经第1轮淘选富集后的抗体库， 并测滴度。如此进行3轮淘选富集， 从第3轮淘选后涂布的LB平板上随机挑取单克隆至含四环素的LB培养基中， 37℃ 220 r/min振摇培养过夜， 菌液离心后收集上清用于下一步实验。

　　1.2.4 ELISA鉴定 将培养的细胞接种于96孔培养板， 以此为抗原板， 克隆上清为一抗， HRP/antiM13为二抗， 进行间接法ELISA， 用ABTS显色后测定A405。实验以空白载体Fuse5为阴性对照， 阳性阈值为阴性对照A405的均值（x）与其3倍标准差（s）之和[3]。选择与肝癌细胞反应强而与正常细胞弱反应或不反应的克隆进行进一步鉴定。

　　1.2.5 硫氰酸铵（NH4SCN）洗脱法阳性克隆相对亲和力测定 按文献[5]报道的方法测定阳性噬菌体克隆的相对亲和力。经NH4SCN洗脱后A405值下降至原来的50%时NH4SCN的浓度即为该抗体的相对亲和力指数， 以mol/L表示， 通过比较相对亲和力指数来衡量亲和力的高低。

　　1.2.6 免疫细胞化学鉴定 培养细胞接种于无菌载玻片， 待贴壁后冷丙酮固定15 min。用SA3噬菌体浓缩上清为一抗， HRP/antiM13为二抗进行免疫细胞化学反应。最后用新鲜配置的二氨基联苯胺(DAB)显色5～10 min， 显微镜下控制染色程度; 苏木素复染， 10 mL/L盐酸乙醇分色， 饱和碳酸锂返蓝后玻片经梯度乙醇逐级脱水， 二甲苯透明， 封片， 镜检。

　　1.2.7 免疫组织化学鉴定 石蜡切片脱蜡下行至水后进入pH6.0的柠檬酸盐抗原修复缓冲液中进行微波抗原修复; 30 mL/L h3O2甲醇室温孵育30 min以封闭内源性过氧化物酶; 其余步骤同免疫细胞化学。

　　1.2.8 DNA序列测定 用质粒小抽提试剂盒抽提噬菌体克隆SA3的DNA进行测序。

　　2 结果

　　2.1 噬菌体单链抗体库的构建 抗体可变区基因连接成scFv后长度为800 bp左右（图1）， scFv克隆入Fuse5后计算所构建噬菌体抗体库的库容量为1.0×108。scFv基因插入率为80%。

　　图1 VH和VL基因连接组装的ScFv基因（略）

　　Fig 1 scFv genes combined with VH and VL genes

　　M: DNA marker; 1-6: scFv genes.

　　2.2 抗体库的淘选和富集 对初级抗体库进行了3轮正负淘选， 洗脱的噬菌体滴度测定显示第2轮和第3轮的回收率逐级增加（表1）， 说明经过淘选后阳性克隆已得到富集。

　　表1 各轮淘选过程中噬菌体的回收率（略）

　　Tab 1 The recall rate of phage in every round of biopanning

　　Recall rate=Eluted phage titer/Input phage titer.

　　2.3 ELISA筛选 从第3轮淘选后的LB平板上随机挑取2798个单克隆培养， 菌液离心后收集上清进行间接法ELISA检测， HepG2阳性率为35%。但这些阳性克隆大部分与QSG7701也有不同程度的阳性反应，　　与HepG2反应强而与QSG7701反应弱且差别较大的克隆有3个， 分别命名为SA1、 SA3和SA10（表2）。

　　表2 HepG2阳性克隆的ELISA结果（略）

　　Tab 2 ELISA results of selected antihepatoma scFv fusion phage clones

　　2.4 NH4SCN洗脱法相对亲和力测定 用NH4SCN洗脱法测定了三个阳性克隆的相对亲和力（图2）。SA1、 SA3和SA10的相对亲和力指数分别为2.3、 2.7和2.4 mol/L。

　　图2 三个阳性克隆的相对亲和力（略）

　　Fig 2 Relative affinities of 3 phage antibodies

　　2.5 免疫化学鉴定 根据亲和力指数决定首先对克隆SA3进行鉴定。免疫细胞化学中细胞经DAB显色后镜检可见克隆SA3与肝癌细胞系HepG2呈较强阳性反应， 细胞质和细胞膜被染成较深的棕黄色， 而其他细胞DAB染色不明显（图3A～D）， 与ELISA结果相一致。免疫组织化学鉴定以切片在显微镜下观察时所见的阳性细胞数的多少判断阳性或阴性， 具体标准如下: 无阳性细胞着色或阳性细胞数&<25%为阴性（－）; 阳性细胞数25%～50%为弱阳性（+）; 阳性细胞数&>50%为强阳性（++）。统计发现克隆SA3与大多数肝癌组织呈阳性反应， 而仅与极少数肝组织呈阳性反应， 阳性率差别有统计学意义（表3）， 阳性部位主要见于细胞膜（图3E～H）。

　　表3 克隆SA3免疫组织化学阳性率比较（略）

　　Tab 3 Comparision of phage clone SA3’s positive rates in different tissues

　　bP&<0.01 vs normal liver.

　　2.6 DNA序列测定和分析 噬菌体克隆SA3 DNA测序结果经Immunoglobin BLAST分析: SA3全长744 bp， 含linker序列42 bp; 重链可变区（VH）处于linker上游， 轻链可变区（VL）处于linker下游; VH基因与人胚系基因IgVH323有93.1%的同源性， VL基因与人胚系基因IgVL545有94.5%的同源性。

　　图3 克隆SA3免疫细胞化学与免疫组织化学染色（略）

　　Fig 3 Immunohistochemical staining of cells and tissues with SA3

　　A: HepG2(×100). Cell membrane and plasmic staining is predominant; B: HUVEC(×100). Negative reaction; C: QSG7701(×100). Negative reaction; D: Negative control(×100); E: Liver cancer tissue (×100). Tissue are stained prominently; F: Liver cancer tissue (×300). Cells are stained prominently; G: Normal liver tissue (×100). Tissue are stained weakly; H: Negative control tissue(×100).

　　3 讨论
　　
　　噬菌体抗体库筛选方法有多种， 目前文献报道的特异性噬菌体抗体多数是由已知的纯化抗原筛选得到的。但在有些情况下抗原纯化是非常困难的（如细胞膜蛋白）， 在这种情况下筛选抗体的难度非常大， 而肿瘤抗原绝大多数都是如此， 所以在很长的一段时间里噬菌体抗体库技术没有用来筛选肿瘤特异性抗体。但近几年， 已经有用完整的细胞当作抗原成功筛选到针对肿瘤抗原的抗体的报道[6]， 如黑素瘤特异性抗体[7]。为了提高从文库中筛选出特异性抗肝癌细胞的scFv的效率， 我们使用了细胞正负淘选法[8]， 即在用肝癌细胞孵育之前， 首先用正常肝细胞对文库进行吸附， 以除去抗体库中与肝细胞表面抗原有交叉反应的抗体。此方法已有不少成功的前例， 如Hemminki等[9]利用这种方法筛选到了特异性抗体。但在本研究中结果并不理想， 原因可能是我们所用的抗原是完整的细胞， 而细胞膜的成分极其复杂， 膜抗原的有效浓度可能很低， 因此噬菌体抗体的非特异性结合很多， 加大了筛选的难度。
　　
　　在实验中我们所用的抗原为完整的细胞， 因此所筛选抗体针对的抗原到底为何尚不确定， 这就使得测定抗体亲和力常数非常困难， 所以本实验只测定了3个阳性克隆的相对亲和力大小， 而其绝对的亲和力指数尚无法检测。而我们筛选的抗体所针对的抗原到底是何种分子也成为了进一步鉴定工作的重要内容， 否则可能直接影响其实际应用。
　　
　　SA3的ELISA、 免疫细胞化学结果显示克隆SA3与肝癌细胞系HepG2呈强阳性反应， 与其他细胞反应不明显。石蜡切片免疫组化结果显示与人肝癌组织和肝组织的阳性率差别有统计学意义。据此可初步判断SA3克隆对肝癌具有良好的特异性， 但其是否能用于肝癌的诊治还需要后续实验进一步的验证。

参考文献

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